修復牙周缺損的細胞膜片構建方法新進展

馮頂麗，卓麗丹，蘆 笛，傅 營 綜述 郭紅延 審校

牙周缺損常見于牙周病和牙周創傷，已經開發的多種材料如骨移植材料、屏障膜和蛋白質產品等，可用于治療牙周缺損，但難以再生完整的牙周組織。近來，隨著組織工程在修復缺損組織中的應用，細胞療法被引入牙周缺損修復。目前已經證明在機體許多成熟組織器官中存在成體干細胞[1]。2004年，Seo等[2]首次從成年人健康的牙周組織中分離培養并鑒定了牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)。在某些特定條件誘導下，該類細胞可“橫向分化”成為其他組織的功能細胞，實現缺損牙周組織的修復和再生。

再生醫學的早期臨床試驗是將種子細胞接種到生物降解的支架中。近幾十年來，開發了一種新的細胞轉移方法，即細胞膜片技術[3，4]，其無需支架，具有巨大的細胞負載能力，可改善干細胞介導的牙周組織再生。筆者就近年來修復牙周缺損細胞膜片的制備及獲取的不同方法進行綜述。

1 種子細胞

1.1 牙周膜干細胞細胞膜片 PDLSC是牙周組織工程的主要種子細胞之一，將PDLSC從牙周組織中提取并進行培養，在細胞對數期，根據需要將細胞接種于不同材質的孔板內，然后用特殊的的培養液加以誘導，制備細胞膜片，一般在21 d左右細胞膜片會逐漸成熟，出現邊緣卷曲現象，此時獲取細胞膜片可用于牙周組織缺損的修復[5,6]。

單一細胞膜片制備相對方便快捷，但存在諸如細胞死亡、骨向分化程度差、血管化不充分、再生結構單一和不完整性等問題 ，不能很好地再生包含軟組織和硬組織的復雜牙周組織。共培養策略通過有效地利用細胞間的相互影響，相互作用可能解決上述問題。細胞分泌的各種因子會協調細胞與細胞間、細胞與細胞外基之間的相互作用并調節新再生組織的結構和功能。因此，通過種子細胞增強細胞外基質的形成和保存能力有益于牙周組織的完全再生。

1.2 共培養MSC與PDLSC構建細胞膜片

1.2.1 PDLSC和骨髓間充質干細胞共培養 PDLSC和骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)由于其強的增殖和分化成牙周組織的能力而在牙周組織的再生工程中受到廣泛的關注。共培養這兩種類型的干細胞，在生理條件下相互作用，同時形成包含有利于組織再生的多種因子的細胞外基質，構建細胞膜片。

共培養PDLSCs和BMMSCs構建的細胞片與單用PDLSCs或BMMSC的細胞膜片相比，表達更高水平的骨和ECM相關的基因和蛋白質，產生的復合組織結構也更類似于體內天然牙周組織[7]。Xie等[8]將人PDLSCs、BMMSC共培養，并通過骨誘導的陶瓷牛骨粉末作為混合型干細胞膜片。當PDLSCs與BMMSC共培養時，ALP活性和增殖動力學上調，同時膠原蛋白Ⅰ，骨鈣素和血管內皮生長因子的表達也上調。在體內，混合型hPDLSC團可以模仿牙周膜韌帶的微環境，促進牙骨質/牙周韌帶樣組織再生中新生血管形成。

1.2.2 PDLSC和牙囊干細胞共培養 牙囊細胞被認為包含可形成牙周膜、牙骨質、牙槽骨的牙周膜前體細胞，這些前體細胞具有很強的干細胞特性，統稱為牙囊干細胞(dental follicle stem cells，DFSCs)。

李欣等[9]使用比格犬DFSC、PDLSC和混合細胞分別制備細胞膜片。然后，三種類型的細胞膜片以同種異體方式移植到具有三壁牙周缺陷的比格犬牙根表面，骨缺損填充羥磷灰石-磷酸鈣(HA-TCP)，設置了填充HA-TCP的對照組。牙周病臨床檢查，組織學和病理分析表明，混合細胞膜片組的牙周愈合優于對照組，相較于其他單細胞組能獲得完整的牙骨質、牙槽骨及規則的牙周膜樣結構。王麗穎等[10]提出將人的PDLSC及DFSC混合共同培養，制成細胞膜片。顯示DFCS可增強PDLSC的自我更新和多向分化的能力并為其提供良好的微環境，促進牙周組織再生。將其與人DFCs、PDLSCs兩種單一細胞膜片進行比較，結果顯示混合細胞膜片細胞層數更多，基質分泌量更大。這一特質為其提供了更好的彈性和更穩定的機械性能，增加了其臨修復牙周缺損的可操作性。

1.2.3 PDLSC和人臍靜脈內皮細胞共培養 Panduwawala等[11]將PDLSC，人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)或兩種細胞的共培養制備細胞膜片。將細胞膜片以三種不同的組合包裹在人牙根周圍，并皮下植入免疫缺陷小鼠。組織學評價顯示，在植入2、4和8周后，與對照相比，在實驗組中植入的牙根周圍觀察到牙周韌帶樣組織排列。此外，在含有HUVEC組的牙周腔內觀察到血管腔。在第4周和第8周的實驗組中，牙周膜韌帶再生，牙骨質生成和成骨都比較明顯。此外，研究表明HUVEC的存在可以促進牙周細胞的遷移[12]。單獨的PDLSCs、HUVECs和各種比例的兩種細胞(1∶1，2∶1，5∶1和1∶5)培養獲得細胞膜片，結果顯示在1：1和5：1共培養組中觀察到更高的堿性磷酸酶(ALP)基因表達，這與ALP蛋白定量一致。與單細胞培養細胞片相比，表現出顯著高水平的骨/牙源性標記與初始血管形成[13]。

功能組織再生強調了有利的細胞外基質環境和新血管的形成。在研究中，將PDLSCs和其他干細胞混合培養重建有利的再生微環境，有助于復雜牙周組織的再生。

2 誘導環境對構建細胞膜片的影響

2.1 培養基中添加維生素C 使用加入不同濃度的維生素C(0、10、20、50 mg/ml)誘導骨髓間充質干細胞(BMSC)構建細胞膜片。研究顯示維生素C誘導BMSCs以劑量依賴的方式形成細胞膜片，培養基中維生素C的濃度為50 mg/ml時細胞膜片形成最快。與對照組相比，能產生和保存較高量的膠原和其他ECM成分。此外，維生素C在提高BMSCs的增殖能力的同時卻不影響膜片的成骨分化能力[14]。Fl Wei等[15]以不同濃度的維生素C構建人PDLSC膜片，結果顯示維生素C可誘導PDLSCs構建高質量的細胞膜片。進一步研究發現維生素C能夠誘導PDLSCs中的端粒酶活性，導致細胞外基質Ⅰ型膠原，纖連蛋白和整合素β1，干細胞標記物Oct4，Sox2和Nanog，以及成骨標記物RUNX2，ALP，OCN的上調表達。該誘導方法與傳統的培養方法相比，被誘導的細胞具有更強的生物活性，保留了細胞間緊密聯系的ECM，而且保留了接近質膜的細胞質微絲和外吐小囊泡，相比更易獲得高質量的細胞膜片。將這兩種方法制備的細胞片植入裸鼠體內后，經維生素C制備的細胞膜片可分化形成更多的成牙質細胞/成骨細胞樣細胞，最終形成更加規則的骨/牙骨質樣基質。在體內，利用維生素C誘導PDLSCs產生細胞外基質構建膜片后植入比格犬的牙周缺損模型，6周后發現有牙骨質/牙周韌帶樣組織形成[16]。

2.2 培養液對PDLSC膜片生物學特性的影響 有研究者取得大鼠發育期根端復合體結構，體外分離并培養細胞，取得上清，制備DAC條件培養液。利用DAC條件培養液和成骨誘導液分別誘導PDLSCs膜片。結果表明，與成骨誘導相比，DAC誘導體系更適合PDLSCs膜片的形成，膜片含有豐富的短棒狀細胞和大量細胞外基質，細胞膜片periastin和堿性磷酸酶(ALP)表達豐富，體外成骨基因表達更高[17]。2011年，有研究發現鼠根端乳頭條件培養基(APTG-CM)可促進PDLCs向成牙骨質細胞譜系轉化的功能，APTG-CM有利于牙周組織再生[18]。2017年，有研究采用骨髓間充質細胞條件誘導液(BMMSCs-CM)與根端牙胚條件誘導液(APTG-CM)分別誘導PDLSCs膜片4、7、10 d。10 d后，BMSCs-CM組的克隆形成率(37%)大于APTG-CM組的克隆形成率(24%)，且BMMSCs誘導液誘導后的PDLSCs膜片可產生更豐富的細胞外基質。掃描電鏡可見BMMSCs組細胞膜片表面有礦化沉積和膠原組織形成，APTG-CM組細胞膜片表面有大量膠原纖維狀組織形成?？梢?，BMMSCs誘導液更有利于牙周組織再生[19]。

3 細胞膜片在材料表面的分離技術

胰酶消化法是目前最常用的細胞獲取的方法，但細胞膜蛋白損傷大，無法保留完整的細胞間連接和細胞外基質，細胞的早期凋亡率高，體內移植后細胞保持活力的時間短[20]。與此方法相比，其他的分離技術顯示了各自的優勢。

3.1 溫敏材料 溫度敏感性材料N-異丙基丙烯酰胺[PNIPAAm]的研發與利用，為胰酶消化存在的上述問題提供了新的解決方法。PNIPAAm材料制備的溫敏性培養皿，用于細胞的培養和非機械性降溫分離獲得細胞片[21]，無需酶消化即可獲得完整的細胞膜片。其主要原理是PNIPAAm會隨溫度的改變呈現不同的整體構型和表面潤濕性。37 ℃時，其表面呈弱疏水性，適于細胞黏附和生長；當溫度低于32 ℃時，表面呈親水性并發生溶脹，從而使細胞與培養皿分離。因此，培養的細胞在低溫下容易從這樣的溫度反應表面完整地分離。然而這種由PNIPAAm材料包被的溫度培養皿較長的冷卻時間會影響細胞功能、PNIPAAm溶解有細胞毒性、PNIPAAm材料的厚度會影響細胞黏附等，因此PNIPAAm聚合物材料進一步改進成為研究熱點。

2009年，WANG等[22]通過將丙烯酸衍生的殼聚糖(CSA)和N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)共聚合成溫敏性聚(PNIPAAm-co-CSA)水凝膠。當培養溫度從37 ℃降低至20 ℃時，CS鏈具有良好的親水性和吸濕性。L929細胞黏附和脫離的研究表明，在37℃時PNIPAAm-co-CSA水凝膠表面上的細胞黏附和擴散比PIPAAm水凝膠的表面具有更加優異的細胞親和力與更快的細胞片脫離。另外也有很多學者對此材料進行了改進[23]，通過各種方法修飾PNIPAAm和PNIPAAm衍生物研制溫度反應性細胞培養表面，極大地改善了細胞膜片的獲取。

3.2 聚電解質涂層技術 聚電解質改性的表面，也可用于控制細胞片的釋放。靜電作用并在電化學極化后從導電基底解吸，可使聚電解質吸附到相反電荷的表面?；谶@種機制，開發了用于收集細胞片的電響應系統。研究表明，在金屬氧化物上的聚(1-賴氨酸)(PLL)接枝的聚(乙二醇)(PEG)單層可以通過基底的電化學極化解吸。利用該原理，可通過施加短的正電位從銦錫氧化物(ITO)中解吸PLL-g-PEG/PEG-RGD單層。換言之，吸附的PLL-g-PEG/PEG-RGD單層成為細胞附著到金屬氧化物底物的媒介。該單層解吸時，細胞會失去其附著點而發生分離[24]。

Zahn等[25]利用離子溶解技術誘導細胞膜片分離。首先合成聚電解質多層膜，接種成肌細胞膜片于該多層膜上，這種聚電解質多層膜由底層的多聚賴氨酸/透明質酸和上層的纖連蛋白組成，在培養基中加入多價陽離子-亞鐵氰化物以分解破壞聚電解質多層膜，從而引起細胞膜片迅速地從培養皿中脫離。

3.3 其他方法 其他的細胞膜片分離技術也在不斷出現，為實現高質量細胞膜片的大量獲取奠定了基礎。例如Ito等[26]利用磁力使角質形成細胞附著和釋放。磁鐵礦標記的角質形成細胞在超低附著板上培養，有磁體放置在平板下方時，細胞會均勻地散布在表面，沒有磁體放置時細胞將無法擴散。 為了分離細胞片，將磁體從平板下面移除，且將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放置在磁體的表面。移動磁鐵到細胞上面，磁力導致角質形成細胞片黏附在磁體表面的PVDF膜上。之后，細胞可隨著PVDF膜從磁體表面分離。Qiu等[27]在云母片表面涂抹 A6K溶液，接種成骨細胞在該表面層。當細胞膜片成形且邊緣卷起時，無須改變溫度，即可用鑷子將細胞膜片迅速而完整地從表面分離，與其他分離技術相比，這種分離方式更為簡便，且因沒有添加其他毒副材料，具有更高的生物安全性。

綜上所述，包含軟組織和硬組織的功能性牙周樣組織的再生是牙周組織的組織工程修復缺損的最終目標，同時也給科研與臨床應用帶來很大的挑戰。與單細胞移植方法相比，細胞膜片的細胞密度和移植效率更高，可高效再生修復牙周缺損，具有廣泛的臨床應用前景。目前細胞膜片在動物實驗中研究較為廣泛。雖然其牙周組織再生的效果是肯定的，然而，細胞膜片在牙周再生中的應用還處于初級階段，仍需要不斷的深入研究與改進。

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