猴痘病毒感染血清抗體ELISA檢測方法的建立

任皎 葉飛 趙莉 管茜茜 趙穎 宋敬東 田厚文 譚文杰

北京102206,中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所

猴痘是由猴痘病毒感染引起的一種罕見、散發、天花樣人獸共患傳染疾病。猴痘病毒是痘病毒科正痘病毒屬成員,1958年丹麥哥本哈根國家血清學研究所在對食蟹猴的痘樣疾病進行研究時發現了該病毒,由此而命名。在正痘病毒屬中有多種能導致人類疾病的病毒,如天花病毒(已被人類消滅)、猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒等。猴痘病毒毒力較強,但感染性和致病性均弱于天花病毒。猴痘臨床癥狀與天花相似,但病情相對天花較輕,病死率為1% ～10%。主要表現為皮膚出現類似天花的水皰或膿皰,有發熱、頭痛、全身不適、淺表淋巴結腫大等前驅癥狀。早期出現的淋巴結腫大是猴痘區別于天花的一個特征。在當今,全球天花已被消滅三十多年,而猴痘病毒依然存在于自然界中,威脅著人類健康[1]。

猴痘的病原猴痘病毒目前發現僅分布在非洲國家熱帶雨林地區,其首要宿主為嚙齒類動物。猴痘病毒1970年才在剛果民主共和國首次發現感染人類,至今絕大多數病例都發生于剛果盆地和西部非洲的農村地區,其中發生最多的是在剛果民主共和國。然而,在2003美國因進口非洲寵物鼠,引發了5個州共47例猴痘感染者的疫情[2],這是首次出現的非洲大陸之外的猴痘流行報道,說明在全球旅游和貿易一體化時代該病可以跨越自然疫源區的地理界限迅速蔓延。最近幾年中西非猴痘疫情較為活躍,如2017年3月,剛果(布)地區暴發20例猴痘病例,死亡 3例[3]；2017年 9月至 2018年 9月WHO網站報告尼日利亞269例猴痘疑似病,115例實驗室確診病例,病死7例[4]。2018年9月英國首次報道了猴痘輸入病例2例[5]。雖然目前我國還沒有發現猴痘輸入性病例,也沒有在動物宿主中發現該病毒,但隨著我國對非貿易以及非洲務工人員和旅游者人數的日益增多,客觀上加大了猴痘疫情輸入風險。我國在2006年就建立了猴痘病毒特異的實時熒光定量PCR檢測方法,還缺乏抗體檢測的方法,本研究參考國外學者關于人猴痘病毒感染血清抗體檢測相關研究結果[6-7],合成2個猴痘特有的多肽抗原,通過2017年我國在塞拉里昂-中國友好生物安全實驗室的1例猴痘病毒感染者血清,初步建立了猴痘病毒感染血清IgG抗體的ELISA檢測方法,旨在為猴痘的流行病學研究和臨床輔助診斷提供技術支持；為我國應對可能出現的猴痘疫情以及生物反恐提供技術儲備。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞痘苗病毒天壇株(TK+)來自原衛生部藥品生物制品檢定所,批號7601,由本室保存。143TK―細胞(人骨髓瘤細胞)由上海生物化學研究所惠贈,購自美國標準培養物保存中心(ATCC)。

1.2 猴痘多肽來源于猴痘病毒B21R蛋白的B21R179/180多肽(氨基酸序列：VAEALNDMF KEFDKNVSAIIIKEEDNYLNS)和B21R185/186多肽(氨基酸序列：RNKYRTRKYEIMKYDNMSIKSDHHD SLETV)的合成及與BSA的偶聯均由北京中科亞光生物科技有限公司完成,各10 mg,純度大于90%。

1.3 血清樣品正常人血清(成年人體檢血清)30份,巨細胞病毒(CMV)感染者恢復期血清1份,痘苗病毒天壇株實驗室感染者恢復期血清1份(RENVV-30),痘苗病毒李斯特株實驗室感染者恢復期血清1份(ZZ-VV-60),2017年塞拉利昂猴痘患者發病后12 d和55 d血清各一份(SLLA-D15,SLLAD55),以上血清均由本室保存。

1.4 猴痘病毒血清抗體檢測用PBS配制含B21R179/180BSA和B21R185/186BSA混合二肽(濃度均為500 ng/ml)的抗原包被液,酶標板每孔加入100μl,4℃過夜包被。用PBST洗板三次拍干后,每孔加100μl含10%小牛血清的PBS,37℃封閉1 h。洗板后用抗體稀釋液(含10%山羊血清的PBS)將待檢血清作倍比稀釋,起始稀釋度為1∶50,100μl/孔,37℃孵育1 h。洗板拍干后分別加入1∶20 000稀釋的HRP標記的羊抗人IgG二抗,37℃孵育1 h,洗板加入TMB底物溶液100μl/孔,室溫暗處放置5～10 min左右,硫酸終止反應,450 nm測OD值。以正常人血清為陰性對照,在相同稀釋度情況下實驗組血清測得的OD值等于或大于2.1倍正常人血清的OD值時定義為陽性,用血清稀釋度表示,相反則定義為陰性。

1.5 正痘病毒血清抗體ELISA檢測痘苗病毒抗原的制備：痘苗病毒天壇株按0.01 PFU/細胞感染143TK―細胞,加入含2%胎牛血清的培養基,待細胞全病變后離心收集細胞,凍融3次,超聲波粉碎后離心去除細胞碎片,收集上清用36%蔗糖12 000×g超速離心純化病毒,沉淀用適量的PBS懸起,分裝至凍存管,用免疫噬斑染色法測定病毒滴度,-80℃保存。以純化的痘苗病毒包被酶標板(每孔106PFU)[11],4℃包被過夜,倒盡板孔液體后 PBS洗滌液3次,含10%山羊血清的PBS封閉37℃1 h,加入不同稀釋度待測血清,37℃作用1 h,其余步驟同1.4。

2 結果

2.1 猴痘抗原特異性鑒定為了鑒定合成的B21R179/180-BSA、B21R185/186-BSA抗原的特異性和抗原活性,以上述混合二肽作為包被抗原(抗原包被量200 ng,每種肽100 ng),選擇正常人血清(成人體檢血清)、痘苗病毒感染者恢復期血清(REN-VV-30、ZZ-VV-60)、CMV 病毒感染者恢復期血清以及塞拉利昂猴痘患者血清(SLLA-D12,SLLA-D55),通過間接ELISA方法對上述血清進行猴痘IgG抗體的檢測,從而對肽的特異性進行初步評價。由圖1可看出,B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA猴痘多肽混合抗原與塞拉利昂猴痘患者的2份血清在血清稀釋度為1∶50-1∶200之間時反應均很強,且OD值隨血清隨稀釋度的增大而逐漸降低,而正常人血清、痘苗病毒感染者血清和CMV病毒感染者血清與B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA混合猴痘多肽抗原呈現弱的反應,由此說明 B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA猴痘混合肽抗原與猴痘病毒IgG抗體具有特異性反應。

圖1 猴痘多肽抗原特異性鑒定結果Fig.1 Identification of the specificity of peptides antigen by ELISA

2.2 猴痘 B21R179/180-BSA和 B21R185/186-BSA混合肽抗原包被量的優化將B21R179/180-BSA和B21R185/186-BSA二肽抗原用PBS包被液,分別以 25 ng、50 ng、100 ng、200 ng 包被酶標板孔,正常人血清和塞拉利昂猴痘確診患者血清按1∶50稀釋,二抗從1∶5 000開始倍比稀釋,從圖2可看出,根據不同抗原包被量在不同二抗稀釋度下的塞拉利昂猴痘患者血清與正常人血清的OD比值(P/N值)以及正常人血清的OD值綜合分析,抗原的最佳包被量為100 ng(二肽各含50 ng),二抗稀釋濃度為1∶20 000。

圖2 多肽抗原包被量優化Fig.2 Optimal quantity of peptides antigen for coating micro-plate

2.3 猴痘病毒血清IgG抗體檢測cut-off值確定及樣品檢測以上述優化條件(100 ng的B21R179/180-BSA、B21R185/186-BSA猴痘混合肽抗原包被,二抗1∶20 000稀釋)對正常人血清庫中隨機抽取30份血清進行抗原本底反應檢測,同時對塞拉利昂猴痘患者血清進行檢測。如圖3所示,在血清稀釋度為1∶50時,猴痘特異性多肽抗原的本底反應OD均值為0.187,以陰性血清OD值的2.1倍設為ELISA檢測的陰陽性判斷標準,因此cut-off值為0.393。從圖4 A可以看出,根據此cut off值判斷塞拉利昂猴痘患者雙份血清的檢測結果,IgG抗體均呈強陽性反應(OD值大于2)。從圖4B可以看出,在感染后12 d的血清,與感染后55 d的血清抗體水平相近,滴度為 1∶6400。

圖3 ELISA檢測正常人血清及cut-off值確定Fig.3 Detection of antibodies in normal serum samples by ELISA and determination of cut-off value

2.4 塞拉利昂猴痘患者血清正痘IgG抗體檢測通過以痘苗病毒為包被抗原的正痘病毒血清抗體ELISA檢測,2017年塞拉利昂猴痘確診患者發病后12 d和55 d血清(SLLA-D15,SLLA-D55)均能檢測到正痘IgG 抗體,滴度分別為1∶200、1∶800。 由此可見塞拉利昂猴痘患者血清正痘IgG抗體檢測結果是與基于猴痘多肽抗原的猴痘病毒IgG抗體檢測結果相符的。

3 討論

A：血清1：50稀釋時檢測OD值；B抗體滴度檢測圖4 猴痘感染者血清IgG抗體檢測結果A：OD value for detection of serum of 1∶50 dilution； B：Detection of antibody titreFig.4 Detection of IgG antibody against monkey-pox virus in serum samples collected from patient infected by monkey-pox virus

猴痘病毒感染與天花病毒感染相似,經常被誤診為雞痘(由水痘-帶狀皰疹病毒感染引起)[8-9],導致無法依靠臨床癥狀來確診猴痘,特別是曾經接種過天花疫苗的人,再感染猴痘病毒后臨床癥狀輕微甚至無臨床癥狀[9]；Jezek等[10]報道初次感染猴痘病毒后并沒有典型的臨床癥狀如出疹。此外,也有文獻報道,猴痘病毒西非毒株毒力較剛果盆地毒株弱,臨床癥狀較輕。目前國際上普遍采用的猴痘病毒感染確診判斷方法為美國CDC官網[4]公布的：臨床癥狀加流行病學背景和實驗室檢測三者結合。實驗室檢測推薦的方法是PCR,具有高度的靈敏性。然而,這種方法嚴格依賴于感染期病毒的存在,同時也依賴于臨床樣品的正確采集、儲存。這些都限制了單一PCR診斷的準確性,因此二種或多種方法的聯合使用對于提供準確的實驗室檢測診斷是必要的。有研究發現正痘病毒的IgG抗體最早在出疹后2 d就可檢出,因此血清IgG抗體的檢測窗口期可以從出疹幾天到感染恢復后幾十年。值得一提的是作為臨床患者的猴痘病毒感染實驗室確診方法,單份血清標本IgG抗體陽性不能確診猴痘病毒感染,單份標本抗體檢測陽性時,僅可臨床診斷為疑似或可能病例,確診需要急性期和恢復期雙份血清標本,恢復期IgG抗體滴度較急性期有4倍或以上升高。

本研究通過與塞拉里昂-中國友好生物安全實驗室合作,利用2017年3月塞拉里昂1份猴痘感染病例的血清對合成的猴痘病毒混合二肽抗原進行了特異性和敏感性評價,初步建立了猴痘病毒感染血清IgG抗體的間接ELISA檢測方法。該方法有較好特異性,且操作簡便,對儀器設備要求不高,適于大規模流行病區高危人群的血清流行病學調查,以及作為實驗室PCR方法的聯合檢測診斷。但由于猴痘感染血清標本很有限,本研究中只根據文獻研究中得出的最佳混合肽抗原進行包被檢測[6-7],沒有將2個肽分別作為包被抗原的血清檢測結果進行比較,有待于應用更多猴痘感染病例血清進行進一步的驗證和優化。

利益沖突無