一種新型HIV-1 DNA檢測試劑的臨床應用評價

李龍 杜聰 趙芳凝 徐斌 鄭敏娜 李宗娜 周寧 龔卉 郭燕 程紹輝 于茂河

300011天津市疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制室(李龍、趙芳凝、鄭敏娜、周寧、龔卉、郭燕、程紹輝、于茂河)；300400天津精耐特基因生物技術有限公司(杜聰、徐斌、李宗娜)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的致病因子[1]。HIV是一種雙鏈RNA逆轉錄病毒,進入人體后選擇性入侵人體免疫系統的CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞,在細胞內經逆轉錄合成cDNA,并整合進入宿主細胞的基因組DNA中,形成前病毒。隨后以前病毒為模板,利用宿主細胞內的RNA轉錄、剪切、蛋白翻譯、包裝等機制生產更多的HIV病毒顆粒并釋出細胞外。如此周而復始,感染更多的CD4+T淋巴細胞[2]。HIV感染的診斷是艾滋病預防控制工作要解決的首要問題。要確認是否感染HIV病毒,可以通過檢測HIV的病毒核酸、抗體、抗原、或病毒分離培養等方法。而DNA檢測在艾滋病早期診斷以及抗病毒治療后患者的HIV-1潛伏細胞群即病毒儲藏庫內前病毒的監測中具有重要意義[3-4]。目前國內外尚未見單獨檢測HIV DNA的同類試劑上市,各實驗室采用的方法多為內部科研方法,方法的標準化程度不夠,缺乏可比性。本研究是對一種新型HIV-1 DNA檢測試劑的臨床應用性能指標進行評價,為后續的臨床應用提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源2017年4～11月,天津市疾病預防控制中心艾滋病確證中心實驗室依照《全國艾滋病檢測技術規范》2015版[5]進行檢測判斷的結果為HIV抗體陽性樣品59例,陰性樣品36例,HIV抗原抗體診斷試劑檢測陽性且對比試劑1(Western blot,WB確證試劑)檢測結果不確定的樣本17例,弱陽性標本1例,特異性標本8例。所有樣本均為全血樣本,進行盲法編號后-30℃凍存。標本采集獲得患者或家屬知情同意。

I/II型人類嗜T細胞病毒(HTLV-I/II)、巨細胞病毒(CMV)、甲型流感病毒(Influenza A)、EB病毒(EBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、抗核抗體(ANA)、類風濕因子(RF)特異性樣本各1份,由天津醫科大學總醫院提供,本實驗室用特異診斷試劑進行復核。

1.2 主要試劑人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA檢測試劑盒(PAP核酸擴增實時熒光PCR法)為天津精耐特基因生物技術有限公司研制(批號：09H13Q)；對比試劑1：人類免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗體蛋白印跡試劑盒,MP Biomedicals Asia Pacific Pte.Ltd.(批號：AE6028)；對比試劑 2：人類免疫缺陷病毒1型核酸定量測定試劑盒(PCR-熒光法)雅培貿易(上海)有限公司(批號：478846)；人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒,北京萬泰生物藥業股份有限公司(批號：H20161010)

1.3 實驗操作及結果判定

1.3.1 感染狀態判定：依照《全國艾滋病檢測技術規范》2015版進行檢測,使用確證試劑(對比試劑1)判斷樣品的感染狀態,對于確證結果為不確定的樣本,進行隨訪檢測,隨訪檢測仍為不確定的以核酸結果判斷感染狀態。特異性樣本采用經國家藥監局批準注冊有證產品進行檢測復核。

1.3.2 HIV-1 DNA檢測：盲法編號的樣本解凍吸取200μl全血進行基因組DNA提取,操作按照說明書(QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit)進行,注意需要延長蛋白酶K的消化時間至2～4 h,以徹底清除各種蛋白質類抑制物。將已提取好的DNA樣本、陽性對照、陰性對照分別加入1組檢測孔(2孔/組)中,每孔分別加入17μl。加樣結束后蓋緊蓋子并震蕩混勻,離心去除氣泡。按照說明書設定擴增反應程序(96 ℃ 2 min,1個循環；96 ℃ 12 s、60 ℃ 30 s、64℃ 30 s、68℃ 30 s,40個循環),將八聯管置于熒光PCR儀(BioRad CFX96)中,待反應結束后讀取各樣本的Ct值,Ct≤39判定為陽性,Ct＞39判定為陰性。實驗結果解盲后進行數據統計分析。

1.4 統計學方法主要分析指標：以HIV感染狀態(樣品的HIV-1感染狀態結果)為相對標準,分析考核試劑的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%的置信區間,并用SPSS統計軟件對考核試劑和HIV-1感染狀態結果進行Kappa檢驗。次要分析指標：以HIV感染狀態(樣品的HIV-1感染狀態結果)為相對標準,分析考核試劑和對比試劑2的陽性檢出例數,陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%的置信區間,并用SPSS統計軟件對考核試劑和對比試劑2檢測結果進行Kappa檢驗。

2 結果

2.1 HIV-1DNA試劑檢測結果與HIV-1感染狀態結果比較本次實驗共入選97例,最終取得有效結果并納入統計95例(有兩例樣本經隨訪檢測結果為不確定且核酸檢測失敗)。結果見表1,考核試劑陽性符合率為100%(59/59),95%CI：93.94% ～100%；陰性符合率為 100%(36/36),95%CI：90.26% ～100%；總符合率為100%(95/95),95%CI：96.19% ～100%；Kappa值為 1,95%CI：1.00 ～1.00,表明考核試劑檢測結果與抗體檢測結果(HIV-1感染狀態結果)一致。

表1 HIV-1DNA試劑檢測結果與樣品的HIV-1感染狀態結果比較(n)Tab.1 Comparison of HIV-1 DNA test results and HIV-1 infection status of samples(n)

2.2 HIV-1DNA試劑檢測結果與RNA定量檢測試劑檢測結果比較對比檢測試劑2與考核試劑在檢測結果上出現差異,結果見表2,考核試劑陽性符合率為100%(41/41),95%CI：(91.40% ～100%)；陰性符合率為76.74%(33/43),95%CI：(61.37%～88.24%)；總符合率為 88.10%(74/84),95%CI：(79.19% ～94.14%),Kappa值為0.736,95%CI：(0.629～0.897)。

表2 HIV-1DNA試劑檢測結果與對比試劑2檢測結果比較(n)Tab.2 Comparison of the results of HIV-1DNA reagent and reference reagent 2(n)

2.3 弱陽性,不確定,特異性樣本結果分析

2.3.1 HIV-1DNA試劑對于弱陽性標本檢測的準確性驗證：HIV-1抗體弱陽性樣本(復檢抗體檢測OD0.229)共入選1例,結果見表3,按照規范進了補充試驗,對比試劑1(WB檢測試劑)結果為不確定,隨訪檢測仍為不確定。首次檢驗樣本對比試劑2(RNA定量)檢測結果為：37 544拷貝/ml。對于弱陽性樣本考核試劑檢測結果為陽性,與對比試劑2檢測結果一致。

2.3.2 考核試劑對于HIV抗原抗體檢測陽性且對比試劑1(WB確證試劑)檢測結果陰性的檢測：共入選10例,最終取得有效結果并納入統計10例,考核試劑檢測結果均為陰性,對比試劑2(RNA檢測試劑)結果均為陰性,對比試劑1(WB確證試劑)結果均為陰性,三者結果一致。

2.3.3 HIV抗原抗體檢測陽性且對比試劑1(WB確證試劑)檢測結果不確定的樣本：共入選17例,最終取得有效結果并納入統計15例(有兩例樣本經隨訪檢測結果為不確定且RNA檢測失敗)。這15例不確定標本通過隨訪檢測結果為陽性,或對比試劑2(RNA檢測試劑)檢測結果數值＞5 000拷貝/ml?？己嗽噭z測結果均為陽性,考核試劑檢出率100%。

2.3.4 特異性樣本檢測驗證：共入選8例,最終取得有效結果并納入統計8例,使用考核試劑及對比試劑1(WB確證試劑)、對比試劑2(RNA檢測試劑)進行檢測,評價考核試劑的特異性；考核試劑及對比試劑1結果為陰性,對比試劑2檢測結果有一例檢測失敗其余為未檢出(表4)。

3 討論

本試劑盒采用以焦磷酸化激活的聚合反應(pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)[6]為基礎的核酸擴增技術來擴增HIV-1前病毒的高度保守區域,同時采用熒光標記的引物發出實時熒光信號,從而實現對HIV-1 DNA和內源性人類基因組DNA總量的檢測。該試劑為定性試劑,其特殊的PAP法通過使用特異阻斷性引物,把焦磷酸化反應和聚合反應串聯耦合而達到最佳效果,具有超高的靈敏度和選擇性,使用血樣標本即可檢測宿主細胞中被整合的HIV病毒基因,可以從摻雜的10億個幾乎完全相同的核酸分子(包括DNA和RNA)中直接特異性地擴增出1個拷貝的靶基因。

表3 1份弱陽性樣本檢測驗證Tab.3 Verification for one weakly positive sample

表4 8份特異性樣本驗證Tab.4 Verification for eight specific samples

該試劑在對于感染早期的不確定標本檢測中顯示出一定的優勢,在15例不確定標本中檢測結果為陽性,而這15例標本通過隨訪檢測確證結果為陽性,或對比試劑2(RNA檢測試劑)檢測結果數值＞5 000拷貝/ml?？己嗽噭z出率100%。另外該試劑在假陽性、特異性標本檢測中顯示出良好的特異性。在10例HIV抗原抗體檢測陽性且對比試劑1(WB確證試劑)檢測結果陰性,證實該試劑可有效排除四代試劑產生的假陽性結果。在8例特異性標本的檢測中,考核試劑及對比試劑1結果一致,無假陽性結果出現。

對比檢測試劑2與考核試劑在檢測結果上出現差異,考核試劑陽性符合率為100%,陰性符合率為76.74%,總符合率為 88.10%,所得Kappa值為0.736。調查樣本的流行病學資料,分析其原因為納入統計的樣本患者已經接受了抗病毒治療,經過抗病毒治療后血漿中HIV-1 RNA降至低于檢測下限[7],而感染者的血液、精液或淋巴結中仍有大量HIV-1前病毒DNA存在,構成病毒儲藏庫[8-9]。所以出現了部分樣品考核試劑檢測結果為陽性而對比試劑2結果為陰性。對比檢測試劑2出現了多例檢測失敗,原因可能為HIV-1 RNA對樣本質量要求較高,容易受到樣本中血紅蛋白、三酰甘油的影響,對于發生嚴重溶血的樣本無法完成檢測。文獻報道當血紅蛋白濃度為97 g/L時HIV RNA和試劑內標質控均未被檢出[10],而DNA檢測試劑對樣本質量兼容性更高,成功完成了檢測。

本研究表明,考核試劑檢測結果與HIV-1感染狀態一致,可以認為與現在我國所采用的HIV-1檢測試劑等效,且能有效鑒別出感染早期的不確定標本。與進口RNA定量檢測試劑盒相比,能有效的檢測出接受抗病毒治療患者的病毒儲藏庫中HIV-1 DNA,具有良好的臨床應用價值。

利益沖突無