Axin1基因多態性與隱睪易感性的相關性研究

唐鐵龍，黃靜，鄒兵，譚春林，付劍，李鑫

(川北醫學院附屬醫院泌尿外科·泌尿生殖疾病研究室，四川 南充 637000)

隱睪是新生男孩中最常見的先天性異常，影響3.5%的男性新生兒[1]。雖然常被認為是一種中度畸形，但其是不育和睪丸癌最主要的危險因素。研究表明隱睪是多因素導致的疾病[2]，大量的研究支持遺傳因素在隱睪發病中的作用[3-4]。

體軸抑制因子(axis formation inhibitior,Axin)，最初是從小鼠的分析鑒定融合基因，在胚胎發育過程中起著關鍵的作用。Axin1是與多種蛋白反應的多結構域的腳手架蛋白并且通過B-聯蛋白復合體在WNT信號通路中作為一個關鍵的負性調控因子。研究表明，WNT信號通路在隱睪的疾病發展中起做至關重要的作用[5-9]。此外，Axin1不僅參與調節Wnt信號通路，也參與調節TGF-β、SAPK /JNK和p53信號通路[10-11]。對老鼠的研究表明Axin1功能完全失活導致早期胚胎致死率在9.5 d，并伴有前腦截斷，神經管缺陷，和胚胎軸重復。Axin1可能參與胚胎和出生后的發育與疾病[12-13]。因此，隱睪風險和Axin1基因可能有關聯。

Axin1基因位于染色體16p13.3 的一個65 kb的區域內。為了研究Axin1是否與隱睪的發病相關，實驗在中國漢族人中散發的113例隱睪患者和179名健康對照人群研究了Axin1的3個標簽SNPs和隱睪發病的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

研究獲得川北醫學院附屬醫院倫理委員會批準，所有參與者的父母提供書面同意。實驗組收集113例隱睪患者和179名不相關健康志愿者。實驗組來自2008年9月到2012年6月入住川北醫學院附屬醫院患者?；純撼錾蟪Ｒ庴w檢并且在3個月齡重復體檢，應用SCORERK定義隱睪及體檢結果。所有的檢查都是在溫暖的環境下嬰兒仰臥位的條件下進行的。將睪丸沿正常下降途徑的熟練操作到最末端的位置記錄睪丸的位置，但不使用暴力扭轉?；純?歲左右行睪丸固定術之前再次確認診斷。單側隱睪92例，雙側隱睪21例；其中腹股溝淺袋32例，陰囊前間隙28例，外環27例，腹股溝管內17例，內環9例。對照組來源于包皮環切術患兒，年齡1個月～10歲，平均年齡(3.8±1.2)歲。早產或低出生體重的任何個人史或家族史的隱睪癥或其他嚴重疾病被排除在外(包括患兒和對照組)。所有的病例都來自居住在中國西南的四川漢族人。

1.2 SNP的篩選及基因分型

標簽SNP在基因組某個區域中具有高度連鎖不平衡(2個或多個位點的等位基因的非隨機關聯性)的代表性SNP。根據標簽SNP基因分型在HapMap計劃的CHB人口抽樣數據選擇標簽SNPs。Axin1基因的標簽SNPs位于內含子區域的rs370681，rs12921862和位于同義密碼區域的rs1805105，是從國際性HAMMAP項目(http://WWW.hapmap.org/index,html.zh)用tagger parwi-seTagging算法為中國北京的漢族人中挑選出來的。每個個體基因組DNA是通過DNA提取試劑盒提取bioteke(北京，中國)從200 mL EDTA抗凝外周血樣本的。并按照說明書的步驟進行操作程序。

引物順序和DNA序列分析的限制性內切酶見表1。隨機抽取10%的樣本進行重復檢測，結果與之前的結果100%一致。

1.3 統計學分析

所有的數據分析都是運用的SPSS 17.0軟件。3個SNP的基因型頻率是通過直接計算所得到，HARDY-WEINBERG平衡是通過方差檢驗評估得到呈現共顯性，顯性，隱性，超顯性或者Log-additive遺傳模型病例-對照模型基因型關聯測驗是用SNPstates完成。

OR值和95%CI評價等位基因與基因型間的差異性。P<0.05被認為在隱睪患者和健康對照組之間有統計學意義。

表1 引物序列和酶

2 結果

3個標簽SNP在113例隱睪癥患者和179名對照者中都被成功地基因分型。3個多態性的基因型分布符合hardye-weinberg平衡。Axin1基因標簽SNPs等位基因頻率見表2。隱睪患者rs370681位點中T等位基因頻率明顯高于對照組(P=2e-4，OR1.96，95%CI 1.37～2.78)但rs1805105和rs12921862多態性的等位基因頻率在隱睪患者和對照組之間沒有差異(P=0.119，OR0.732，95%CI 0.502～1.067；P=0.245，OR1.572，95%CI 0.785～3.148)。

如表3所顯示，患者和對照組的rs370681多態性分布明顯不同。與C/C基因型相比，C/T基因型攜帶者隱睪癥的風險增加2.17倍(P= 6e-04，95%CI1.28～3.70)。而且在共顯性組中T/T基因型隱睪風險增高4倍(P=6e-04，95%CI 1.79～9.09)與C/C基因型相比，在顯性組中C/T-T/T基因型隱睪風險增高2.44倍(P=4e-04，95%CI 1.47～4.00)。同時，與C/C-C/T相比較，T/T基因型隱睪風險增高2.56倍(P=0.012，95%CI 1.22～5.26)。

此外，觀察到rs1805105多態性的基因型差異顯著。與T/T相比較，C/C-C/T基因型隱睪風險增高1.64倍(P=0.041，95%CI 1.02～2.63)，此外，與T/T-C/C基因型相比，C/T基因型攜帶者隱睪癥風險增加1.72倍(P=0.032，95%CI 1.05～2.86)。在rs12921862多態性與隱睪癥風險的遺傳模型中沒有觀察到顯著的關聯。

表2 Axin1標簽SNPs等位基因頻率與隱睪患病相關性[n(%)]

表3 實驗組和對照組Axin1標簽SNPs基因型頻率與隱睪患病相關性[n(%)]

3 討論

隱睪，也稱睪丸下降不全，是新生男孩的一種最常見的先天性異常[14]，并且被認為是睪丸癌形成的危險因素。Pathak等[15]綜合21篇病例對照研究的流行病學的Meta分析中提出，對于曾經罹患過隱睪的患者，患有睪丸癌的OR值從3.5～17.1，總的相對危險度為4.8(4.0～5.7)。雖然有幾種發病機制用于解釋隱睪，但在大多數病例，隱睪癥的原因尚不清楚[16]。一些學者發現疾病有家族聚集性，隱睪癥家族史是隱睪癥的危險因素。初步研究發現6.2%隱睪患者的兄弟和1.5%～4.0%的隱睪患者的父親患有隱睪癥[17-19]。綜上所述，遺傳因素可能對隱睪癥的發展起一個至關重要的作用。

Wnt信號通路調節脊椎動物和無脊椎動物的細胞的增殖、分化、形態和運動[8]，多項研究已經證實Wnt信號通路在小鼠胚胎和出生后的發育和疾病的重要性[5,12,20-22]，并有研究發現Wnt信號通路的激活可能與隱睪發病相關[9]。Axin1是野生型Axin基因，該通路的負調節因子，被認為在胚胎發育過程中發揮重要作用。廣泛表達的Axin1參與了胚胎神經軸的形成[23-26]?？傊?，Axin1可能在隱睪的發展中扮演做一種重要的角色。在選擇的Axin1 3個標簽SNPs中，兩個SNPs位于內含子區，另1個SNP位于同義密碼子區域。證據研究表明內含子和其他非蛋白編碼RNA在高等生物中可能作為網絡控制分子，使得這些生物從一個簡單的單輸出蛋白遺傳操作系統的限制中釋放出來[27]。因此，標簽單核苷酸多態性可能會作為控制區去影響其他基因的傳導影響其他基因的行為，而不是通過影響氨基酸的翻譯去影響蛋白質的結構.

實驗研究了Axin1基因的遺傳變異對隱睪的影響，并且觀察到隱睪患者和對照組的Axin1基因SNPs的等位基因和基因型頻率變化具有顯著差異，為Axin1基因的rs370681基因多態的T/T基因型和rs1805105基因多態的C/T基因型在隱睪患者中的頻率更高提供了重要的證據。結果提示這些等位基因和基因型可能是隱睪發展的危險因素。