代謝型谷氨酸受體1阻滯劑LY367385對NMDA所致神經元損傷的保護作用

楊軍蘭 趙天智 謝云*

(1西北婦女兒童醫院醫學檢驗中心，陜西 西安 710061; 2空軍軍醫大學唐都醫院神經外科，陜西 西安 710038)

谷氨酸(glutamate, Glu)是中樞神經系統中最重要的一種興奮性神經遞質，在中樞神經系統的許多生理和病理過程扮演了重要角色[1]。然而，谷氨酸的過度釋放可以通過與離子型(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)的作用，直接引起興奮性神經毒性，這一過程也參與了腦外傷、中風、帕金森病等多種神經系統疾病的病理過程[2-4]。目前，在代謝型谷氨酸受體家族中，研究最廣泛的是亞型1和5。已有研究表明，激活代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)可以導致大鼠癲癇發作的頻率顯著增加[5-6]，并且抑制mGluR1對沙鼠腦缺血損傷有保護作用[7]。此外，mGluR5可以通過與突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95, PSD95)相互作用，從而調控下游的一系列信號分子[8]。然而，mGluR1調控谷氨酸信號轉導的具體機制尚未明確。本實驗利用N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)激活突觸后膜的NMDA受體，以獲取興奮性神經元損傷模型，用mGluR1特異性阻滯劑LY367385 [(+)-2-甲基-4-羥基苯甘氨酸]抑制mGluR1的作用，進而了解其在神經元興奮性損傷中的具體作用。

材料與方法

一、試劑

孕16 d清潔級SD大鼠，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。改良伊格爾培養基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)高糖培養基和胎牛血清(Hyclone公司)，羥乙基哌嗪乙硫磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES)(Farco公司)，PSD95抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，GluN2B抗體(美國NeuroMab公司)，NMDA(美國Sigma公司)，細胞裂解液(上海碧云天生物科技研究所)，喹啉酸蛋白濃度測定試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)，二抗(美國Santa Cruz Biotechnology)。

二、神經元細胞分離及培養

解剖孕16 d SD大鼠，取出胎鼠，分離腦皮質組織，剪碎，0.25%胰酶37 ℃消化30 min后，加入完全培養液終止消化，離心后去上清，培養液洗滌一次后再次離心，去上清，加2 mL完全培養液輕輕吹打形成細胞懸液，通過200目濾網過濾，以5×105/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被的24孔板。完全培養液：DMEM高糖培養基13.4 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，青霉素G 100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，HEPES 1.19 g/L，N2添加劑13.4 g/L，胎牛血清10%。神經元隨機分為3組：對照組：不做任何處理；NMDA組：10 μM NMDA 處理；NMDA+LY367385組：50 μM LY367385預處理1 h后，再加入10 μM NMDA處理，各組均為5。

三、細胞活性測定

將細胞按2×103個/孔接種于96孔培養板，設置6個平行孔及空白對照，分別進行相應處理后每孔加入20 μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h后，棄去培養基，加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)，震蕩15 min，酶標儀490 nm波長下測定各孔吸光度值(optical density, OD)，繪制細胞增殖曲線。

四、細胞培養基乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量測定

神經元進行相應處理后，收集上清，依據試劑盒說明測定LDH含量。

五、轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)法檢測細胞凋亡

4%多聚甲醛固定細胞，用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution tween, PBST)沖洗后按照檢測試劑盒說明書操作，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色觀察細胞核形態，計算平均陽性細胞率，即凋亡指數(apoptosis index, AI)。

六、免疫共沉淀

神經元經過相應處理后，提取蛋白并與Protein A/G beads和GluN2B抗體或PSD95抗體孵育過夜。樣品經Western blot檢測。

七、蛋白質免疫印跡法(Western blot)檢測

神經元經過相應處理后，RIPA法裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法定量。在12%聚丙烯凝膠中電泳，轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，配制適當濃度一抗4 ℃孵育過夜。PBST漂洗后，加入用辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫封閉2 h，PBST漂洗后加發光液顯影。

八、統計學分析

結 果

一、mGluR1阻滯劑LY367385對NMDA所致的神經元損傷有保護作用

分別用濃度為1 μM、10 μM、50 μM和100 μM的LY367385處理神經元1 h后，向培養基中加入10 μM NMDA造成神經元細胞興奮性損傷，24 h后測定細胞活性。同樣方法處理細胞后，收集細胞培養基上清，測定細胞培養基中LDH含量。我們發現，與NMDA損傷組相比，10 μM、50 μM和100 μM LY367385預處理后，細胞活性明顯增加，并且LDH含量明顯降低(P<0.05)。見圖1。為深入探討LY367385的作用，我們選取50 μmol/L的LY367385進行進一步實驗。

圖1 mGluR1阻滯劑LY367385對NMDA所致的神經元損傷有保護作用

Fig 1 The mGluR1 antagonist LY367385 protects against NMDA-induced neuronal injury

A: Cell viability; B: LDH release.

aP< 0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

二、mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經元凋亡

用10 μM NMDA 處理神經元細胞24 h后，AI值(39.08%±8.36%,P<0.05)與對照組(5.42%±2.59%,P<0.05)相比顯著升高(P<0.05)。50 μM LY367385預處理1 h后，再加入10 μM NMDA處理細胞24 h，AI值(19.96%±8.71%,P<0.05)較NMDA處理組顯著降低(P<0.05)。見圖2。表明NMDA可以造成的神經元凋亡，而mGluR1阻滯劑LY367385可以減輕神經元凋亡，對NMDA引起的神經元損傷有保護作用。

圖2 mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經元凋亡

Fig 2 The mGulR1 antagonist LY367385 inhibits NMDA-induced neuronal apoptosis

A: TUNEL staining; B: Apoptotic rate.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

圖3 LY367385可以抑制NMDA造成的NR2B-PSD95表達增加

Fig 3 LY367385 attenuates the formation of NR2B-PSD95 complex

A: Co-IP of NR2B with PSD95; B: CO-IP of PSD95 with NR2B.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

三、LY367385可以抑制NMDA造成的GluN2B-PSD95表達增加

應用免疫共沉淀分析GluN2B-PSD95相互作用結果，以進一步分析mGluR1與PSD95在體外是否相互作用。以GluN2B的抗體進行免疫沉淀，在免疫沉淀產物中檢測PSD95，再以PSD95的抗體進行免疫沉淀，在沉淀產物中檢測GluN2B，結果提示，GluN2B與PSD95存在內源性的相互作用。見圖3。

討論

mGluRs廣泛分布于中樞神經系統，是一個G蛋白偶聯受體家族，目前已知有8種亞型。根據其結構同源性、藥理學特性和傳導通路分成3組，目前研究最為廣泛的主要是第一組mGluRs，包括mGluR1和mGluR5[9]。mGluRs被激活后，通過激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)引起磷脂酰肌醇(phosphoinositide, PI)水解，產生二?；视?diacylglcerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)，從而引起胞質內Ca2+增加，產生一系列的生理和病理反應。本實驗觀察了mGluR1特異性阻滯劑LY367385對NMDA引起的神經元細胞興奮性損傷的作用，發現LY367385對減輕NMDA引起的神經元細胞凋亡有一定的作用，并且可以影響GluN2B-PSD95復合體的表達。

突出后致密物(postsynaptic density, PSD)是位于中樞神經系統突出后膜下的高電子密度特化區，主要由谷氨酸受體及相關的支架蛋白及信號通路蛋白組成[10]。PSD95是其中一種主要的蛋白成分，參與了多條信號通路的表達和作用。NMDA受體是iGluRs家族中重要的類型，也是PSD的重要組成部分。NMDA受體可以通過NR2亞基的C末端與PSD95的PDZ1結構域直接連接，形成NMDAR-PSD95復合體。PSD95還可與其他突觸后結構蛋白相連，如GKAP和Shank，后者還可以間接與mGluRs胞內末端連接[11-12]。由PSD95連接的這種復雜的突觸后細胞網絡有可能參與和調控了多種胞內信號通路的作用。在NMDA損傷的神經元中，用LY367385阻斷mGluR1后，GluN2B-PSD95復合體的表達顯著減少。因此，mGluR1可能通過與突觸后致密物質PSD95的相互作用影響NMDA受體功能，從而減輕細胞興奮性損傷，發揮神經保護作用。

LY367385對抗NMDA所致的神經元損傷的作用表明，mGluR1在神經系統興奮性損傷中起了重要作用，mGluR1的阻滯劑有望成為新的神經保護劑。