超聲輔助提取異葉茴芹多酚的工藝優化

段菁菁 王志新 董瓊

[摘要]以異葉茴芹為材料，用有機溶劑乙醇作為提取劑，結合超聲波提取法對異葉茴芹多酚進行提取。用單因素實驗法分別考察不同提取條件（乙醇濃度、料液比、超聲溫度及時間）對異葉茴芹多酚提取量的影響，得出單因素最佳提取條件為料液比1：100、乙醇濃度40%、超聲時間80min、超聲溫度60℃。再進行正交實驗，篩選多酚提取條件。結果表明，超聲輔助提取異葉茴芹多酚最佳提取條件為料液比1：110、乙醇濃度50%、超聲時間100min、超聲溫度60℃。

[關鍵詞]異葉茴芹;多酚;超聲輔助提取

[中圖分類號]R284.2[文獻標識碼]A

異葉茴芹（Pimpinella diversifolia DC.）屬傘形科茴芹屬多年生草本植物，分布廣泛，產湖南、浙江、廣東、安徽等地，在國外分布于越南、阿富汗、尼泊爾等地。異葉茴芹常生長在山腳下和路邊草叢的陰濕處，濕地山溝等地。異葉茴芹被當作一種常見的中草藥，有祛除風寒、消除腫痛等功效?？捎糜卺t治風寒感冒、咳嗽、結核、痢疾、小兒疳積。也可將新鮮的異葉茴芹磨碎外敷，用于治療血液循環毒素中毒、化膿性炎癥、全身性瘙癢癥等。植物多酚是一類具有大分子質量的多元酚類化合物，是廣泛存在于植物體內的次生代謝物。多酚含有多種生物活性，可除去機體內過量的自由基，同時起著保護機體內大分子物質的作用。多酚也能夠對機體內的脂肪代謝產生重要的作用，可被用于治療心腦血管疾病。此外，多酚還具有一定的抗腫瘤活性，能夠有效地防癌抑癌，有極大的應用前景。盡管目前植物多酚提取的方法多樣，所用的植物材料來源豐富，但關于異葉茴芹多酚的提取研究和報道甚少。本實驗通過超聲輔助提取異葉茴芹多酚，利用單因素實驗法考察影響異葉茴芹多酚提取量的主要因素，在單因素實驗結果的基礎上進行正交實驗，得出異葉茴芹多酚提取的最優提取條件，為今后異葉茴芹多酚開發利用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

TD5A-WS臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），XY-C電子天平（常州市幸運電子設備有限公司），BJ-150多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司），ZQ6-180R單槽式超聲清洗儀（上海爭巧科學儀器有限公司），2721G可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）。

材料和試劑：異葉茴芹購自浙江省溫州市永嘉縣。無水乙醇;沒食子酸;無水碳酸鈉，以上試劑均為分析純。福林酚試劑（BR級）：1mol·L-1。

1.2 方法

1.2.1 異葉茴芹多酚提取。用粉碎機將干燥的異葉茴芹粉碎，過60目篩，密封保存。稱量1g異葉茴芹粉末，加入乙醇溶液，設置不同的單因素實驗條件進行超聲處理，其中按實驗的要求來設定相應的乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度。在50mL的離心管內加入經超聲處理后的提取液后于3000r·min-1下離心10min，待離心機停止運行時，再將離心管內的液體部分倒出，用蒸餾水定容到200mL，得到待測液。室溫密封保存。

1.2.2 異葉茴芹多酚提取量的測定。參考張瑛的實驗方法稍作修改，稱量質量為0.1g的沒食子酸純凈粉末，使其溶于70%的乙醇溶液中，定容，得100mL的沒食子酸樣液。取10mL沒食子酸樣液，再用70%乙醇定容到100mL，制成標準溶液，其濃度為100?g·mL-1。

取六個10mL容量瓶，依次加入體積為50?L至300?L的沒食子酸標準溶液，每份相差50?L。依次加入1950?L至1700?L蒸餾水，每份相差50?L。各加1mL福林酚，混勻，放置5min，此操作過程需要在暗處進行。分別加10%的碳酸鈉溶液1mL，混勻后遮光靜置2h。760nm下測定吸光值，計算得到線性回歸方程。

移取0.5mL待測液置于10mL容量瓶，采用和標準曲線制作相同方法測吸光值，按下式計算：

式中：E代表多酚提取量（mg·g-1），X代表異葉茴芹待測液中多酚的濃度（μg·mL-1），V代表提取溶液定容后的體積（mL），M代表粉末狀異葉茴芹的質量（g）。

1.2.3 單因素實驗。分別考察料液比（1：80、1：90、1：100、1：110、1：120）、乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、超聲溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）以及超聲時間（20min、40min、60min、80min、100min）對于異葉茴芹多酚提取量的影響。

1.2.4 正交實驗。通過之前的實驗分析，得到最優的單因素提取數值，再進行L9（34）的正交實驗。

2 結果

2.1 沒食子酸標準曲線

以吸光度為縱坐標，沒食子酸溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性方程為y=0.1145x+0.0153，R2為0.9939。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 料液比對異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖1可知，異葉茴芹提取液中的多酚含量隨著物料與液體比例的減小呈現出先增大后減小的趨勢，在圖中橫坐標料液比為1：100時對應有最大的多酚提取量。當提取溶劑的體積增大時，異葉茴芹粉末能夠與溶劑更充分地接觸，促使溶液中的多酚被更充分地提取出來。若提取劑太少，異葉茴芹含有的多酚不能被充分提取出來，當溶劑體積逐漸增大，多酚的提取量也逐漸增大，溶劑到達一定體積時，多酚已被基本提取出來。再繼續增大溶劑的體積，不僅會造成溶劑的浪費，也讓超聲波造成的機械效應變得不再明顯，使多酚提取量減少。

2.2.2 乙醇濃度對異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖2可知，異葉茴芹多酚提取量隨著乙醇濃度的增大呈現先升高后降低的趨勢，乙醇濃度為40%時，異葉茴芹多酚的提取量最大。多酚易溶于乙醇。逐漸增大乙醇濃度，使得多酚能夠充分溶解在乙醇和水的復合體系中。接著增大乙醇的濃度，異葉茴芹多酚的提取量反而降低，是由于一些易溶于水的多酚存在于植物細胞的液泡當中，當乙醇的濃度過大時，蛋白質的空間結構發生改變，蛋白質變性，阻礙了液泡中的多酚被提取，降低了提取液中多酚的含量。

2.2.3 超聲溫度對異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖3可知，異葉茴芹多酚提取量伴隨超聲溫度的升高而增大，超聲溫度達60℃時，異葉茴芹多酚提取量最大，超聲溫度大于60℃，異葉茴芹多酚提取量開始減少。因為溫度升高會使分子的擴散速率加快，導致植物細胞內多酚的提取速率和提取量增大，溫度高于60℃，會引起一些聚合反應以及氧化還原反應的產生，使得異葉茴芹的多酚提取量降低。另外，有機溶劑具有揮發性，異葉茴芹中某些其他成分在溶液內的溶解度會伴隨乙醇的揮發而增大，影響測量的結果，使得異葉茴芹多酚的提取量降低。

2.2.4 超聲時間對異葉茴芹多酚提取量的影響。由圖4可知，一定時間范圍內，超聲時間延長，異葉茴芹多酚提取量增大。超聲時間達80min時異葉茴芹多酚提取量最大，在80min后便開始減少。因為異葉茴芹多酚溶出至提取液需要一定時間，當提取時間過短時，異葉茴芹多酚沒有被充分提取出來，隨著超聲時間的增加，多酚提取量不斷上升，在超聲時間為80min時，異葉茴芹多酚被充分地提取出來。但若超聲時間太長，則會因長時間的高溫作用，致使多酚的分子構象發生變化，降低提取量，并且也增加不必要的生產成本。

2.3 正交實驗結果

設計四因素三水平L9（34）正交實驗，如表1所示。從正交實驗結果表2中可知，RD>RC>RA>RB，由此可知，異葉茴芹多酚提取量的最大影響因素和最小影響因素分別是超聲溫度和乙醇濃度。提取異葉茴芹多酚的最優條件為A3B3C3D2。

3 討論

本實驗采用超聲波輔助乙醇法從異葉茴芹中提取多酚，得出單因素最適條件為乙醇濃度40%，料液比1：100，超聲時間和溫度為80min和60℃。進行正交實驗最終得到異葉茴芹多酚提取的最佳條件：乙醇濃度50%，料液比1：110，超聲時間及溫度分別為100min和60℃。其中，對異葉茴芹多酚提取量影響最大的因素是超聲溫度，影響最小的是乙醇濃度。

本實驗選取乙醇和水的復合體系作為提取劑。姚永志的研究表明用乙醇這類有機溶劑比用水作為提取劑的多酚提取率大。且乙醇與其他常見的有機溶劑（乙醚、乙酸乙酯等）相比，對人體的危害較小，成本低，后續廢液的收集及處理方便。但濃度過高的乙醇會使蛋白質變性，使得水溶性多酚難以被提取出來，影響多酚的提取量，因此選擇濃度適宜的乙醇溶液作為提取劑就尤為重要。本實驗初期設置了多個乙醇濃度梯度，濃度分別為20%至70%，組成一組含六個濃度梯度的單因素實驗組，重復實驗三次得出最佳乙醇濃度為40%。

本實驗選擇超聲輔助提取的辦法，超聲波可導致植物細胞壁破裂開來，使得異葉茴芹中的多酚更好地滲出，大大提高了提取效率和多酚提取量。有學者在研究中比較了幾種植物多酚的提取方法，如李青在研究皇冠梨的多酚提取工藝時，使用了有機溶劑法、微波輔助提取法和超聲波輔助法，發現超聲波輔助法提取皇冠梨多酚的提取率最高。超聲提取比其它提取方法更具優勢，其操作程序簡單，耗能較少，提取率高，以及操作風險相對較小。因此，在本研究中選擇超聲波輔助提取的辦法。

不同實驗材料受提取條件各因素影響的程度不同，劉德明提取金蕎麥莖葉中的多酚，發現超聲時間為關鍵影響條件。呂丹提取山楂皮中總多酚，結果表明乙醇濃度對總多酚提取率有最大影響。本實驗中異葉茴芹多酚提取量的關鍵影響因素為超聲溫度，且在溫度為60℃時，異葉茴芹多酚提取量達到最高。隨溫度升高，提取溶液系統的熱能升高，分子熱運動速率加快，利于多酚提取。但隨超聲溫度的升高，提取劑中乙醇更容易揮發，影響異葉茴芹多酚的提取，控制超聲溫度尤為關鍵。

本實驗采用福林酚法測定異葉茴芹提取液中的多酚含量，需要注意控制提取液中多酚與福林酚發生反應的時間，本實驗參照實驗方案中所及文獻，選擇反應時間為2h，并統一反應時間，避免造成實驗誤差過大。本實驗雖已對異葉茴芹多酚的超聲提取工藝進行一定的優化，但未與其它異葉茴芹多酚提取方法進行比較。另外，本實驗主要對異葉茴芹全株多酚進行提取和測定，未對植株不同部位的多酚含量進行深入研究，建議后續工作可嘗試多種多酚提取方法，以及比較異葉茴芹不同部位的多酚含量，更合理地開發和利用異葉茴芹。

[參考文獻]

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第五十五卷第二分冊）[M].北京：科學出版社，1985.

[2] 危英，張旭，危莉，等.黔產異葉茴芹揮發油化學成分的研究[J].貴陽中醫學院學報，2004（01）：62-63.

[3] 董立莎，趙志華.民藥異葉茴芹的生藥鑒定[J].貴陽中醫學院學報，1991（03）：62-64.

[4] 林櫻姬，趙萍，王雅.植物多酚的提取方法和生物活性研究進展[J].陜西農業科學，2009，55（06）：105-107.

[5] 張瑛.花生衣多酚的提取、純化及其活性研究[D].太原：山西大學，2016.

[6] 潘匯.荷葉中多酚類物質的提取，分離及抗氧化構效關系的研究[D].蕪湖：安徽工程大學，2018.

[7] 鄭賢明.橄欖葉多酚提取純化及抗氧化活性的研究[D].福州：福建農林大學，2012.

[8] 李華，王蔚新，袁春龍.葡萄籽多酚提取物的提取工藝研究[J].食品研究與開發，2005（06）：69-72.

[9] 鄭濤.青杄針葉多酚提取工藝及抗氧化活性研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[10] 姚永志，左錦靜，王子涵.乙醇提取花生紅衣多酚物質的研究[J].中國油脂，2007（03）：51-53.

[11] 姚永志，王子涵，左錦靜.水作溶劑提取花生紅衣多酚物質的研究[J].現代食品科技，2006（04）：110-112.

[12] 李青.武威地區皇冠梨中多酚提取工藝優化及其抗氧化性研究[D].蘭州：甘肅農業大學，2018.

[13] 劉德明，劉永賢，鄧娜，等.金蕎麥地上部莖葉中多酚的提取工藝研究[J].現代農業科技，2019（06）：225-227.

[14] 呂丹，唐克慧，王宇弛，等.同步提取山楂皮中總多酚、總黃酮和三萜類物質的工藝優化[J].河南工業大學學報（自然科學版），2018，39（05）：69-75.