血清miR-31可用于非小細胞型肺癌診斷

劉日清，黃仁林，梁 柱

1廉江市人民醫院心胸外科，廣東 廉江 524400；2廣東醫科大學附屬醫院心胸外科，廣東 湛江 524021

非小細胞型肺癌（NSCLC）只有約20%可以早期切除，然而在接受手術的患者中，大約50%復發，主要復發原因是遠處轉移[1]。NSCLC預后的主要影響因素是腫瘤的臨床分期，但是既往研究發現，具有相同臨床分期和其他臨床特征的患者的預后存在顯著差異，而通過將分子生物標志物的評估與傳統癌癥分期相結合可以改善NSCLC的管理[2]，miRNA轉錄后調節靶基因的翻譯并影響一系列細胞功能如增殖、分化和凋亡。目前已有大量研究發現惡性腫瘤組織中miRNA表達發生明顯改變，且與預后和治療結果相關，miRNA能夠提供比單獨的單個標記物或基因表達譜的表達更準確的預后預測[2-3]。miRNA-31作為目前臨床研究較少的一種微小RNA分子，在部分臨床研究及動物實驗中被發現作為一種致癌基因參與肺癌的發生發展，且通過針對特定腫瘤抑制因子進行抑制[4-5]。有研究在192例原發性結直腸癌標本中發現miR-31過表達可能參與原發性結直腸癌的發展和進展[6]。但截至目前，臨床關于miRNA-31在NSCLC中的研究仍十分匱乏，且臨床研究稀少。本研究關注于血清中miR-31的表達與NSCLC的關系，以期發現血清miR-31作為NSCLC新的分子標志物的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇我院及廣東醫科大學附屬醫院2017年1月～2019年1月NSCLC患者42例。納入標準：患者都經由病理確診，符合美國國家綜合癌癥網絡提出的《非小細胞肺癌指南》中的診斷及分期標準；術前未進行放療、化療等治療措施；術前血常規、肝腎功能正常者。排除標準：合并其他肺部疾病如間質性肺炎；妊娠期或哺乳期患者。獲得上述患者的肺癌組織標本和癌旁組織標本，并抽取該42例患者和40例對照健康人群的外周血。42名患者年齡68.5±4.6歲，男性24名，女性18名；36例患者有吸煙史，6例不吸煙；其中I期18例，II期15例，III期9例。本次研究經過我院醫學倫理委員會審批后實施。

1.2 標本處理

規范收集新鮮切除手術標本，在離體后迅速放入凍存管，存入-80 ℃保存。術前1 d抽取外周血3～5 mL后置于EDTA抗凝管中，靜置30 min，4 ℃下1500 r/min離心20 min，取上層清亮血清至RNAse-free EP管中，置于-80 ℃保存。

1.3 實驗流程

1.3.1 總RNA的提取 肺癌組織和癌旁組織采取TRIzol試劑（Invitrogen公司）一步提取法，具體操作按照說明書進行。使用分光光度計測量RNA濃度和純度，取1 μg總RNA，100 V電壓下進行瓊脂糖凝膠電泳30 min，觀察RNA完整性。提取的總RNA分裝在EP管中，-80 ℃下保存。

1.3.2 逆轉錄 參照miRNA反轉錄試劑盒說明書操作進行（試劑由銳博生物生產）。反應體系共15 μL（在7 μL逆轉錄混合液體系中加入5 μLRNA和3 μL逆轉錄引物）。反應條件為42 ℃轉60 min，75 ℃i10 min。

1.3.3 RT-PCR 采用TaqMan探針法，按照試劑盒說明書操作（北京晶典生物）。反應體系包括cDNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL， Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，10×SYBER Green 0.5 μL，ddH2O 6.5 μL。反應條件為95 ℃反10 min，95 ℃i15 μL，60 ℃560 s，共40個循環。反應結束后讀取Ct值。

1.4 統計學處理

miRNA相對表達量用2-△△Ct法計算，所有數據利用SPSS19.0軟件處理，計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗或方差分析，ROC曲線分析miR-31對NSCLC的診斷效能。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測miR-31的結果

miR-31的擴增曲線呈S型，曲線平滑，溶解曲線為單峰，無雜峰信號，未出現非特異性擴增和污染（圖1）。

圖1 miR-31的PCR結果

2.2 miR-31在肺癌組織和癌旁組織中的表達

miRNA在NSCLC組織中表達水平的2-△△Ct值為5.46±4.19，在相應癌旁組織中為3.79±7.08。肺癌組織miR-31表達水平顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。

2.3 miR-31表達與NSCLC臨床特征的相關性

單因素分析結果表明，miR-31在NSCLC組織中的表達水平與臨床分期，是否淋巴結轉移相關，與年齡、病理類型、病理分級無關（P＜0.05）。進一步多因素Logistic回歸分析發現，臨床分期和是否淋巴結轉移是miR-31 表達水平的獨立危險因素（表1、2）。

2.4 miR-31

在血清中的表達及組織和血清miR-31表達量的相關性miR-31在NSCLC患者中的血清表達水平為3.13±1.94，在正常人中的血清表達水平為1.23±2.28，NSCLC患者血清miR-31表達水平高于正常人（t=4.07，P=0.0001）?；颊叻伟┙M織和血清中的miR-31的水平呈正相關（r=0.909，P=0.001，圖2）。

表1 NSCLC組織中miR-31表達與臨床特征的單因素分析（Mean±SD）

表2 NSCLC組織中miR-31表達與臨床特征的多因素分析

圖2 組織miR-31和血清miR-31表達水平的相關性

2.5 血清miR-31水平對NSCLC的診斷效能

圖3 miR-31與NSCLC的ROC曲線

通過ROC曲線得知，當曲線下面積最大時，面積為0.803，此時敏感性為0.829，特異性為0.763（圖3）。

3 討論

microRNAs已被確立為在肺癌發展，上皮-間質轉化和治療反應等過程中具有相關作用的參與者[7-8]。在切除的腫瘤樣本或細針抽吸樣本中測量的miRNA已成為腫瘤診斷，預后和治療反應預測的引人注目的生物標志物，因為它們易于檢測并且極端特異性[9]。痰、血漿、血清或全血中存在的miRNA越來越多地被探索為用于早期檢測癌癥的侵入性較小的生物標志物[10-12]。miRNA31是一種進化上保守的miRNA[13]，位于人類染色體9q21.3上，并與CDKN2和IFNA家族的簇相鄰，是多種人類癌癥中基因組丟失的熱點[14]。目前，miR-31已被發現在包括乳腺癌[15]、肺癌[16-17]、結直腸癌[18]和成人T細胞白血病[14]等多種癌癥組織中表達異常。本研究結果發現，NSCLC組織miR-31顯著高于癌旁組織，NSCLC患者血清miRNA水平顯著高于正常人血清，表明miR-31參與NSCLC的發生發展。有研究也同樣發現正常人體肺組織中miR-31中的3P、5P表達量均遠低于肺腺癌組織中的miR-31中3P、5P表達量[19]，提示肺癌組織存在miR-31基因突變。有研究發現MET、PIK3C2A、GRB10等均為miR-31的直接靶基因[20]，miR-31一方面能通過抑制多種腫瘤轉移相關基因抑制腫瘤轉移過程，包括靶向抑制大腸癌中RASAl基因和乳腺癌中RhoA基因的表達；另一方面，miR-31作為致癌因子能通過抑制某些腫瘤抑制因子LATS2和PPP2R2A來抑制特定肺癌細胞的功能。但是，某個特定microRNA在腫瘤細胞中異常表達不一定會促進癌癥的發生和擴增，miR-31在NSCLC組織中的異常高表達可能是腫瘤表型的多種機制的綜合作用結果。研究結果顯示，NSCLC臨床分期、是否存在淋巴結轉移是影響miR-31表達水平的獨立性危險因素，miR-31診斷NSCLC的敏感性0.829，特異性0.763，表明miR-31參與NSCLC疾病的進展，且針對NSCLC有較高的臨床診斷價值。

本項研究關注miR-31對NSCLC診斷的價值，希望能發現NSCLC新的分子標志物，提高診斷的準確性，為病人提供更精細化的疾病管理。研究發現miR-31在NSCLC中表達上升，血清miR-31可以作為較好的監測指標。但miR-31在肺癌的發生發展中發揮什么樣的作用及其機制，仍需要更進一步的研究加以論證。

[20]侯春英.MET-PI3K-Akt信號通路介導miRNA--31調控肺腺癌腫瘤干細胞功能[D].北京： 北京協和醫學院,2016.