微血管密度、VEGF及受體FLK-1在宮頸癌中的作用及意義

程艷芬，曹宏偉，崔志新，萬立野

（承德醫學院附屬醫院放射科，河北 承德067000）

微血管生成是腫瘤發生、發展的基礎，檢測腫瘤組織內的微血管密度（microvessel density，MVD）可幫助了解其血供特點以及腫瘤細胞的活性，判斷腫瘤進展與轉移的能力。VEGF是腫瘤組織細胞中特異性最高的血管調控因子，它作用于細胞上的特異性受體（FLK-1等），刺激血管內皮細胞增殖、遷移，通過分析宮頸癌組織及癌旁宮頸組織的MVD、VEGF及其受體FLK-1陽性表達率，探討其在宮頸癌組織中的作用，為臨床宮頸癌診療及預后提供理論性依據。

材料和方法

1 一般資料

收集承德醫學院附屬醫院2013年1月至2017年11月手術切除并經病理證實為宮頸鱗癌的組織標本40例，其中13例為角化型，27例為非角化型，患者年齡31～65歲（43.0±7.5）歲。將26例癌旁宮頸組織作為對照組。宮頸癌腫瘤標本取材應避開出血壞死區（部分宮頸部腫塊較大，癌旁正常組織難以取材而未納入對照組）。將宮頸癌標本及癌旁宮頸標本經福爾馬林（10%）固定，常規石蠟包埋。對石蠟包埋組織連續切片，切片厚度為4μm，第一張切片行HE染色，其余用于免疫組化染色。

2 免疫組化技術

取宮頸癌（Ib2～IIb期）腫瘤標本組織及瘤旁宮頸組織，采用Max Vision法進行染色，一抗為兔抗人VEGF及FLK-1多克隆抗體和鼠抗人CD34單克隆抗體，用已知卵巢癌陽性標本作陽性對照，用PBS取代一抗作為陰性對照。顯微鏡下分別對腫瘤及瘤旁宮頸組織的VEGF及FLK-1陽性表達率進行檢測，并進行統計學分析。資料由兩名經驗豐富的病理科醫師協同采集并分析。

3 免疫組化結果的判定

MVD的結果判定采用ORRE等［1］報道的方法，將鄰近血管、腫瘤細胞及與其他結締組織分開的、染成棕色的單個血管內皮細胞或細胞簇定義為微血管，大于8個內皮細胞形成的管腔或未染色的管腔不記數，先在100倍鏡下掃視全片，尋找“熱點”即高微血管密度區，然后在400倍鏡下記數獲得MVD數值（微血管數／mm2），取最高值為微血管數。

VEGF免疫組化染色以細胞質內和（或）胞膜內出現棕黃色顆粒為陽性，FLK-1表達于腫瘤間質血管內皮細胞質內，以棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性表達按VOLM等［2］的判斷標準：①選取染色均勻的腫瘤區，在400倍鏡下計數著色細胞占視野細胞數的百分率，共計數5個視野并取其平均值，按著色細胞占視野細胞總數的百分數分0～3級：0級：無陽性細胞；1級：＜25%；2級：26%～50%；3級：＞50%。②按細胞著色強弱分級：不著色為0級，弱著色為1級，中等著色為2級，強著色為3級。按①②值之和判斷結果：陰性（-）：0；弱陽性（＋）：1～2；中度陽性（＋＋）：3～4；強陽性（＋＋＋）：5～6。

4 統計學處理

統計采用SPSS15.0軟件進行，計數資料采用χ2檢驗，兩組計量資料采用獨立樣本t檢驗，多組計量資料采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

宮頸癌與癌旁宮頸組織MVD差異有統計學意義，P＜0.001，見表1。

表1 宮頸癌與癌旁宮頸組織間MVD對照

圖1～2分別為宮頸癌與癌旁宮頸組織的HE染色圖片；宮頸癌組織的VEGF及受體FLK-1陽性表達率明顯高于癌旁宮頸組織，二者間差異有統計學意義，P＜0.001，見表2。

圖1 宮頸癌HE×10

圖2 正常癌旁宮頸組織HE×200

表2 宮頸癌與癌旁宮頸組織VEGF／FLK-1陽性表達率對照

圖3～6分別為宮頸癌與癌旁宮頸組織的免疫組化染色圖片。宮頸癌組織中MVD值、VEGF及FLK-1陽性表達率與臨床分期及分化程度相關，與浸潤深度無明顯相關，見表3。

表3 不同病理特征宮頸癌MVD、VEGF和FLK-1關系

圖3 宮頸癌組織VEGF（100×）

圖4 正常癌旁宮頸組織VEGF（100×）

圖5 宮頸癌組織Flk-1（100×）

圖6 正常癌旁宮頸組織Flk-1（100×）

討 論

目前，微血管密度（microvessel density，MVD）是評估腫瘤組織內血管生成形態學的金標準。CD34則是標記微血管的常用指標，特異性高，能直觀、敏感并定量評估血管生成的情況，可作為有效標志物判定腫瘤的生物學行為，輔助臨床制定合理治療方案。

有研究證實，腫瘤在無新生血管生成的情況下，腫瘤的大小不會超過1～2mm3［3］，轉基因動物腫瘤模型實驗研究顯示，從原位癌進展到侵襲性癌的過程與微血管的發生緊密相關［4］。臨床分期愈高MVD值也愈高，證明腫瘤的生長、周邊浸潤和轉移均有賴于微血管數量的增加及充分的血液供應。本研究結果顯示宮頸癌組織中的MVD值明顯高于癌旁宮頸組織，二者間差異有顯著統計學意義（P＜0.001），VEGF高表達的病例組比不表達的病例組具有更高的MVD值，這與LEE等［5］的研究結果相符。

VEGF是一種外分泌蛋白，可增加血管的通透性，對血管內皮細胞增殖起主要作用。在腫瘤生長過程中，腫瘤細胞不斷快速的增殖使其處于相對缺氧的環境狀態，此時腫瘤組織通過增加VEGF自分泌過程來刺激血管內皮細胞分裂及增殖，促進癌灶內部新生血管的生成，有利于腫瘤組織的浸潤及生長。BATES等［6］也證實了上述觀點，其研究顯示在胚胎發育以及外傷愈合等供血需求增加的情況下，VEGF呈較高水平表達。目前，針對VEGF與腫瘤間關系的研究已經開展很多，證實VEGF同時存在于腫瘤組織和腫瘤間質的血管內皮細胞中，在鼻咽癌、食管癌、肝癌及肺癌組織中VEGF呈明顯高表達［7-10］。

目前證實VEGF有多種受體存在，而FLK-1則是VEGF的重要受體之一，FERRARA等［11］研究表明VEGF可促進內皮細胞的增殖、增加腫瘤的血管通透性，且主要通過VEGF結合并激活FLK-1受體來實現新生血管的生成。MASSOT等［12］研究表明，VEGF／FLK-1通路刺激內皮祖細胞遷移和血管化，在腫瘤的進展中扮演重要角色。劉維新等［13］研究證實，VEGF及其受體FLK-1在潰瘍性結腸炎及潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌的血管生成過程中起著重要的作用，與炎癥及腫瘤的發生、發展密切相關。本研究結果顯示宮頸癌中VEGF及FLK-1呈現高表達，與對照組間差異均有統計學意義（P＜0.001），在40例宮頸癌標本中VEGF／FLK-1的陽性表達率分別為77.5%和82.5%，而癌旁宮頸組織內的陽性表達率僅為23.1%和26.9%，且大部分為弱陽性，證實了VEGF及其受體FLK-1在宮頸癌的生長過程中起著很重要的作用，且二者間存在明顯正相關。

本研究結果顯示宮頸鱗癌組織中MVD值及VEGF／FLK-1陽性表達率與腫瘤臨床分期及病理類型相關，其中IIb期宮頸癌的MVD值及VEGF／FLK-1陽性表達率明顯高于Ib2期組，IIb期與IIa期之間則無明顯差異；非角化型鱗癌組中MVD值、VEGF及受體FLK-1陽性表達率明顯高于角化型組，組間各參數差異均具有統計學意義（P＜0.05），以上結果證實了MVD、VEGF及其受體FLK-1與腫瘤的增殖及發展是緊密相關的，與劉維新等［13］的研究結果相符。另一結果顯示，MVD值及VEGF／FLK-1陽性表達率與浸潤深度無明顯相關（P＞0.05），證實無論腫瘤是否浸潤固有肌層，腫瘤組織內微血管的生成及VEGF／FLK-1均呈現高表達，但二者間差異無顯著統計學意義。

張莉等［14］研究結果顯示在正常宮頸組織、癌旁組織、宮頸癌組織中VEGF-C的表達量依次增加，宮頸癌組織明顯高于正常宮頸組織、癌旁組織。趙炎等［15］研究證實，早期腎癌旁組織中高表達的CD34＋／FLK-1及內皮祖細胞可通過分泌VEGF參與癌旁血管新生，且癌灶的大小與血管內皮干細胞表達呈正相關，推測其可能促進了癌灶的浸潤性生長。本研究中，宮頸癌組織明顯高表達VEGF，癌旁組織的VEGF及FLK-1部分呈陰性表達，少部分呈現弱陽性或中度陽性表達且以弱陽性為主，與上述研究相符。分析少部分宮旁組織陽性表達的原因，可能與這些樣本癌灶體積較大，浸潤性生長有關。

總之，VEGF及其受體FLK-1在宮頸癌的發生發展中起著重要的作用，二者可作為宮頸癌治療的重要標靶，可通過抑制血管內皮生長因子在腫瘤組織中的陽性表達或對其受體FLK-1進行調控，阻止或減緩腫瘤血管生成進程，提高宮頸癌治療后的生存率。