結腸癌Galectin-3、P53和MSH2蛋白表達水平與臨床病理特征及預后的相關性分析

張 羽，時妍妍

（遼陽市中心醫院病理科，遼寧 遼陽111000）

結腸癌是全球發病率較高且預后較差的腫瘤之一。我國是結腸癌高發國家，2015年我國結腸癌發病率占全球24.3%，死亡數占全球22.9%［1］。近年來，隨著人們飲食習慣的改變，我國結腸癌的發病率呈上升趨勢，對人類健康構成了巨大的威脅。結腸癌早期臨床癥狀不典型，許多患者在就診時已發展至晚期。盡管結腸癌的治療已有較大進展，但其預后仍不盡如人意，結腸癌患者五年生存率約為48.8%［2］。蛋白質組學技術在對實體腫瘤的分子標志物檢測中顯示出了特有的高靈敏度、特異性，并在腫瘤預后評估中扮演重要價值。近期研究指出，半乳糖凝集素3（Galectin-3）、腫瘤蛋白p53（protein 53，P53）和MutS蛋白同系物2（MutS homologs 2，MSH2）等蛋白異常表達與多種癌癥的發生及轉移密切相關［3-5］。然而，關于Galectin-3、P53和MSH2在結腸癌患者組織中的表達及與臨床病理特征和預后的相關性尚未見報道。本研究通過分析結腸癌患者組織中Galectin-3、P53和MSH2表達水平，探究三者對結腸癌的臨床價值。

材料和方法

1 研究對象的納入

收集本院2016年1月到2018年1月進行結腸癌手術的結腸癌組織及癌旁組織共140對，于-80℃冰箱保存備檢測。癌旁組織取自同一患者距離癌組織邊緣2 cm。所有納入對象經術后病理切片明確診斷。結腸癌的診斷和分期依據2013年美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南第三版［6］?；颊咧形荒挲g為51歲，年齡分布為34～65歲，平均年齡為49.8±6.7歲。其中男性98例，女性42例；Ⅰ～Ⅱ期患者96例，Ⅲ～Ⅳ期患者44例；腺癌107例，粘液癌18例，未分化癌15例；高分化癌56例，中分化癌60例，低分化癌24例。納入標準：①語言表達能力正常，能與調查人員進行正常的溝通；②研究對象自愿參與本研究。排除標準：①既往有其他腫瘤疾病史者；②排除腦卒中、老年癡呆等神經系統疾病導致的無法采集相關信息和精神分裂癥的患者。本研究的開展經醫院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

2 隨訪

從患者手術完成開始對納入的140例結腸癌患者進行42個月電話隨訪，隨訪日期截止至2018年7月，記錄患者的生存時間。隨訪終點為：①42個月內患者死亡；②42個月內患者退出該項研究；③42個月隨訪結束。

3 免疫組織化學法檢測與免疫染色定量

取結腸癌患者的病理石蠟切片標本，室溫封閉40min（5%血清），加入單克隆抗體Galectin-3、P53和MSH2，堿性磷酸酶二抗4℃孵育。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后分別加入鏈霉親和素-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）和二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）恒溫顯色封片?？贵w均購于Abcam公司。用10×目鏡、40×物鏡顯微鏡進行觀察。應用Image Pro Plus對免疫組化結果進行分析，并按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱評分（immunohistochemical scores，IHS）。HIS＝a×b，a代表陽性細胞百分比：a＝0，無陽性細胞；a＝1，陽性細胞為1%～10%；a＝2，陽性細胞為11%～50%；a＝3，陽性細胞為51%～80%，a＝4陽性細胞所占比例達81%以上。b代表陽性細胞染色強弱：b＝0，陰性；b＝1，弱陽性；b＝2，中度陽性；b＝3，強陽性。

4 Western blot檢測蛋白Galectin-3、P53和MSH2含量

取16對結腸癌組織及癌旁組織冰上裂解2h，制備細胞總蛋白（Proteo Prep?總蛋白提取試劑盒），并測量蛋白濃度。常規恒流進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移的方法將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，以Galectin-3、P53和MSH2單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠或抗兔IgG抗體為二抗，用電化學發光（enhanced chemiluminescent，ECL）顯色劑顯色，對各組蛋白泳道條帶進行灰度掃描分析，檢測Galectin-3、P53和MSH2蛋白的表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參照?？贵w均購于Abcam公司。實驗過程嚴格按照試劑說明書進行。

5 統計學處理

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。正態分布資料以均值±標準差（）表示，兩組和多組間比較分別采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。率的比較采用卡方檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，應用對數秩檢驗（log-rank test）計算生存曲線間的統計學差異。本研究檢驗水準設為α＝0.05。

結 果

1 Galectin-3、P53和MSH2免疫組織化學結果

如表1和圖1所示，與癌旁組織相比，結腸癌組織中Galectin-3、P53和MSH2蛋白免疫組化染色強度增高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 Galectin-3、P53和MSH2蛋白的免疫組化評分（分，）

表1 Galectin-3、P53和MSH2蛋白的免疫組化評分（分，）

分組 例數 Galectin-3 P53 MSH2癌組織 140 9.76±0.41 7.54±0.27 8.31±0.31癌旁組織 140 3.14±0.26 3.14±0.18 2.54±0.16 t值 7.532 4.053 6.683 P值 ＜0.001 0.012 ＜0.001

圖1 Galectin-3、P53和MSH2免疫組織化學檢測結果（400×）

2 結腸癌組織及癌旁組織中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表達水平

取16對結腸癌組織及癌旁組織應用WB技術檢測蛋白表達水平，如表2和圖2所示，相比于癌旁組織，結腸癌組織中Galectin-3、P53和MSH2蛋白表達水平增高，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 結腸癌組織及癌旁組織中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表達水平（）

表2 結腸癌組織及癌旁組織中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表達水平（）

分組 例數 Galectin-3 P53 MSH2癌組織 16 6.78±0.71 6.01±0.62 6.32±0.59癌旁組織 16 1.98±0.28 1.03±0.14 1.84±0.24 t值 6.480 9.034 5.863 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖2 結腸癌組織及癌旁組織中Galectin-3、P53和MSH2的蛋白表達水平

3 Galectin-3、P53和MSH2蛋白免疫組織化學檢測水平與結腸癌臨床病理特征的關系

Galectin-3、P53和MSH2免疫組織化學水平與結腸癌患者的年齡、性別和組織學類型等因素均無相關 性 （P＞0.05），而 與 結 腸 癌 患 者 分 期（Galectin-3：r＝0.567，P＝0.002；P53：r＝0.552，P＝0.006；MSH2：r＝0.535，P＝0.011）和分化程度（Galectin-3：r＝0.514，P＝0.006；P53：r＝0.501，P＝0.018；MSH2：r＝0.497，P＝0.023）呈線性關聯，且Galectin-3、P53和MSH2蛋白在Ⅲ～Ⅳ期結腸癌及低分化結腸癌患者中的水平增高最顯著，見表3。

表3 Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平與結腸癌臨床病理特征的關系

4 Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平與結腸癌預后

經42個月隨訪，共33例患者死亡，0人失訪。140例結腸癌患者分別依據免疫組織化學檢測的Galectin-3、P53和MSH2水平的中位數分為高Galectin-3與低Galectin-3組、高P53與低P53組和高MSH2與低MSH2組。相比低Galectin-3組，高Galectin-3組生存率顯著降低（χ2＝8.436，P＝0.004，圖3-A）；相比低P53組，高P53組生存率顯著降低（χ2＝4.481，P＝0.034，圖3-B）；相比低MSH2組，高MSH2組生存率顯著降低（χ2＝13.830，P＜0.001，圖3-C）。

圖3 Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平與結腸癌預后

討 論

結腸癌患者腫瘤組織生長迅速，病程進展不易控制，是預后較差的腫瘤之一。由于目前尚無有效的靶向治療藥物，手術治療仍是結腸癌的主要治療手段。雖然近年來關于結腸癌的臨床診療技術得到了顯著提高，但其患者的五年生存率仍維持在較低水平。研究指出，蛋白質組學技術的分子檢測對于腫瘤的預后評估具有較大應用前景，本研究就Galectin-3、P53和MSH2等三個蛋白質分子在結腸癌和癌旁組織中的差異表達分析，旨在找尋結腸癌預后評估的有效分子標志物。

近年來，關于Galectin-3與癌癥間關系在國內外已有多個研究報道。LIU等［7］發現在乳腺癌細胞系中過表達Galectin-3可通過線粒體途徑抑制腫瘤細胞凋亡，并認為Galectin-3是一種新的乳腺癌風險生物標志物。LEI等［8］的研究發現，miR-107可通過靶向作用于Galectin-3，進而抑制Galectin-3的轉錄后翻譯，以抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲與轉移能力。上述研究提示，Galectin-3的差異表達通過干擾多種生物學行為參與腫瘤的發生、發展過程。關于Galectin-3與結腸癌間的關聯研究也有報道。王健寶［9］分析腸癌患者血清中Galectin-3與臨床分期及淋巴轉移的關系發現，Galectin-3與腸癌患者臨床分期及分化程度有關，且隨著腸癌患者臨床分期的增加及分化程度的升高，血清Galectin-3的表達顯著增強。上述研究提示Galectin-3參與結腸癌的進程，然而關于Galectin-3蛋白表達與結腸癌患者預后的分析尚不明確。p53基因是人體重要的抑癌基因，但報道指出多種癌癥細胞內p53基因會發生突變而喪失細胞基因修復功能。王晴等［10］指出p53基因是膀胱癌組織中顯著增高，且高表達的p53蛋白與患者的不良預后相關。近期，PHERMTHAI等［11］的研究發現，癌基因長鏈非編碼RNA H19可扮演競爭性內源核糖核酸而抑制miR-29表達，進而降低miR-29對p53基因表達的抑制功能，促進上皮間質轉化及癌細胞轉移。近期，溫玉婷等［12］對121例結腸癌患者癌組織中P53的表達及與臨床病理特征相關性的分析指出，p53在癌組織中的陽性率顯著高于癌旁組織，且p53水平隨著分化程度的減低而逐漸增高，并提示p53水平增高可能與不良預后有關。本研究旨在探討p53與臨床病理特征的基礎上進一步探討其在結腸癌患者預后中的價值。MSH2蛋白是一類重要的錯配修復蛋白，潘琦等［13］通過體外培養肝癌HepG2細胞系，并經過表達MSH2于HepG2細胞以上調HepG2細胞中MSH2的表達水平，觀察到上調MSH2后可顯著上調下游促癌靶基因Krüppel樣因子4的表達，進而促進HepG2細胞的增殖與遷移能力，并抑制癌細胞凋亡，提示MSH2對HepG2細胞的生物學活性具有促進作用。然而，關于MSH2蛋白在結腸癌患者預后評估的價值尚未見探討與分析。

本研究通過對140例結腸癌組織及癌旁組織的分析發現，與癌旁組織相比，結腸癌組織中Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平顯著增高。此外，Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平與結腸癌患者分期和分化程度呈線性關聯，且Galectin-3、P53和MSH2蛋白在Ⅲ～Ⅳ期結腸癌及低分化結腸癌患者中的水平增高最顯著，提示三者與結腸癌的不良預后密切相關，該部分結果與前期相關腫瘤生物學的研究結果基本相符［7-13］。生存分析發現，高Galectin-3組、高P53組及高MSH2組患者的生存時間顯著短于低Galectin-3組、低P53組及低MSH2組患者，提示結腸癌患者組織中Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平在評估患者預后中具有潛在價值。然而，本研究仍有如下不足：①本研究納入140例結腸癌患者，納入的例數仍然是有限的，后期需要更大樣本量的研究來證實Galectin-3、P53和MSH2在我國結腸癌患者中的臨床價值；②所有研究對象均來源于我院，這可能會造成潛在的選擇偏倚。

綜上所述，本研究證實了癌組織中Galectin-3、P53和MSH2蛋白的差異表達與結腸癌患者分期和分化程度相關，且Galectin-3、P53和MSH2蛋白水平對結腸癌患者的預后評估具有重要意義，這些發現有望為結腸癌的臨床診療提供新的途徑。