二氫楊梅素通過抑制脂質合成途徑改善非酒精性脂肪性肝病

冷清陽 李暢 周建華 劉璐 李娜 龔颯 張浩 李曉華

上海中醫藥大學附屬第七人民醫院內分泌科 200137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種在無過量飲酒的前提下，以肝細胞內甘油三酯堆積過多為特征的肝臟疾病，可表現為單純性脂肪性變、非酒精性脂肪性肝炎、纖維化以及肝硬化。目前尚無美國食品藥品監督管理局批準的用于治療NAFLD的藥物，現在臨床上主要采取運動和改變飲食方式的方法來對NAFLD進行干預，但大多數患者均表示難以長期堅持[1]。因此，迫切需要開發新型有效的治療NAFLD的藥物。

二氫楊梅素是中藥藤茶中活性最高的黃酮類化合物。以往研究顯示，其不僅具有黃酮類化合物抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤的作用，而且可以降糖、調脂、解酒護肝。但其對NAFLD的影響研究較少，作用尚不明確。本研究旨在通過高脂飲食喂養的NAFLD小鼠模型，初步探討二氫楊梅素對NAFLD的改善作用及其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 60%高脂飼料購于美國Research Diets公司；二氫楊梅素購于南京廣潤生物制品有限公司；甘油三酯測定試劑盒購于美國BioVision公司；RIPA(強)裂解液購于上海碧云天生物技術有限公司；蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)購于美國 Roche 公司；BCATAM蛋白濃度檢測試劑盒購于美國Thermo公司；脂肪酸合酶(FASN)抗體及熱休克蛋白90抗體(HSP90)購于美國Cell Signaling Technology公司；固醇調節元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)抗體購于美國Santa Cruz公司；逆轉錄PrimeScript?RT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM購于日本 Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方案 7周齡的C57BL/6J雄性小鼠購于上海斯萊克實驗動物公司，適應性喂養1周后，給予60%高脂飼料喂養16周，采用隨機數字表法將小鼠分為實驗組[高脂加二氫楊梅素組(HFD+DHM組)]和對照組[高脂加溶劑組(HFD+Vehicle組)]，每組各15只，HFD+DHM組通過灌胃的方法給予二氫楊梅素(100 mg·kg-1·d-1)，HFD+Vehicle組給予相應體積的生理鹽水，給藥期間每周測量體重及進食量，給藥至實驗結束共4周。

1.2.2 腹腔葡萄糖耐量實驗 小鼠禁食12 h后進行葡萄糖耐量實驗，按照2 g/kg體重的劑量腹腔注射葡萄糖，并在0、15、30、60、120 min取血測定血糖水平。

1.2.3 胰島素耐量實驗 小鼠禁食6 h后進行胰島素耐量實驗，按照0.75 IU/kg體重的劑量腹腔注射胰島素，并在0、15、30、45、60 min取血，測定血糖水平。

1.2.4 胰島素釋放實驗 小鼠禁食12 h后進行胰島素釋放實驗，按照2 g/kg體重的劑量腹腔注射葡萄糖，并在0、15、30 min取血，測定胰島素水平。

1.2.5 血清生化指標檢測 采用全自動生化分析儀測定甘油三酯、總膽固醇、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。

1.2.6 肝組織病理學觀察(HE染色) 將黃豆大小的新鮮肝臟組織置于4%的多聚甲醛中固定，24 h后依次進行梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。包埋好的組織塊進行切片，HE染色，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 肝臟甘油三酯抽提及測定 稱取30 mg肝臟組織放置于1.5 ml離心管中，加入500 μl的5% NP40，在組織研磨儀上研磨4次(65 Hz，60 s)制成勻漿，85℃水浴5 min，室溫放置10 min，重復1次，14 000 r/min (r=8.48 cm)離心2 min。取上清100 μl置于新的EP管中。用甘油三酯試劑盒檢測。

1.2.8 實時熒光定量PCR實驗 用Trizol試劑提取肝臟總RNA，逆轉成cDNA，用qPCR的方法檢測脂代謝相關基因表達情況，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.9 蛋白免疫印跡法 小鼠肝臟總蛋白采用RIPA裂解液提取，BCA法測濃度，加熱變性。取30 μg蛋白樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移到硝酸纖維素薄膜上，5% 脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃搖床過夜。次日TBST洗膜8 min/次，洗3次，隨后用過氧化物酶標記的抗鼠/抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。最后使用 Image Quant凝膠圖像分析儀曝光成像。

2 結果

2.1 二氫楊梅素對高脂小鼠體重及糖脂代謝的影響 給藥前兩組體重無明顯差異，給藥4周后，HFD+DHM組體重明顯低于HFD+Vehicle組(t=2.161，P<0.05，圖1A)，給藥過程中兩組進食量無明顯改變(圖 1B)。給藥4周后，行腹腔葡萄糖耐量實驗、胰島素釋放實驗和胰島素耐量實驗。結果顯示，二氫楊梅素可明顯改善高脂喂養小鼠的糖代謝水平(圖1C)和胰島素敏感性(圖 1D)，但胰島功能在兩組間無明顯變化(圖 1E)。進一步檢測給藥后小鼠血清中甘油三酯和總膽固醇水平的變化，結果發現，給予二氫楊梅素喂養后小鼠血清甘油三酯含量較對照組明顯降低(t=3.343，P<0.05，圖 1F)。血清總膽固醇結果在兩組間無明顯變化(圖 1G)。

2.2 二氫楊梅素對高脂小鼠肝功能的影響 HFD+DHM組血清AST水平(t=2.562，P<0.05，圖 2A)和ALT水平(t=4.293，P<0.01，圖 2B)均明顯低于HFD+Vehicle組。

2.3 二氫楊梅素對高脂小鼠肝臟脂質沉積的影響 HFD+DHM組肝重明顯低于HFD+Vehicle組(t=2.803，P<0.05，圖3A，封3)。HE染色結果顯示，給予二氫楊梅素治療后，小鼠肝細胞中的脂滴變小、變少(圖3B，封3)，肝脂肪變性減輕。HFD+DHM組肝臟甘油三酯含量明顯低于HFD+Vehicle組(t=7.315，P<0.01，圖 3C，封3)。

2.4 二氫楊梅素對高脂小鼠肝臟脂代謝相關分子表達的影響 HFD+DHM組肝臟脂質合成相關基因如FASN(t=7.116，P<0.01)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1，t=7.234，P<0.01)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1，t=5.846，P<0.01)、SREBP-1c(t=3.2，P<0.05)表達均明顯下調(圖 4A)，而脂肪酸線粒體氧化相關的基因，如過氧化物酶體增殖物活化受體α(PPARα)、中鏈乙酰輔酶A脫氫酶(MCAD)、肉毒堿棕櫚酰轉移酶(CPT)1、脂酰輔酶A氧化酶(ACOX)表達則無明顯變化(圖 4B)。進一步檢測FASN、SREBP-1c蛋白的表達，結果顯示，二氫楊梅素同樣可以下調FASN、SREBP-1c的蛋白表達水平(圖 4C)。

3 討論

NAFLD的發生與不良的飲食習慣和不合理的飲食結構密切相關。大量研究已顯示，高脂飲食可導致NAFLD的發生[2]，且高脂飲食誘導的NAFLD與人類NAFLD發生、發展過程十分相似，故高脂飲食誘導的NAFLD模型被廣泛用于NAFLD的研究[3]。本實驗中肝臟HE染色顯示，采用高脂飲食喂養小鼠16周，成功建立NAFLD小鼠模型。

研究表明，二氫楊梅素具有改善NAFLD患者血糖、甘油三酯、膽固醇以及肝功能的作用，但其作用機制尚不明確[4]。本研究以高脂飲食誘導的肥胖小鼠作為NAFLD模型，研究二氫楊梅素對NAFLD的改善作用及其潛在機制。結果顯示，二氫楊梅素可以降低高脂飲食誘導的NAFLD小鼠體重，改善其糖脂代謝及肝功能，肝臟HE及甘油三酯含量測定結果顯示，二氫楊梅素可以明顯改善肝臟脂肪變性，抑制肝臟脂質沉積。

本研究結果顯示，二氫楊梅素可顯著降低小鼠體重，改善糖代謝和降低血漿中甘油三酯水平。既往研究發現，二氫楊梅素可通過以下兩種途徑改善糖代謝水平：(1)激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)，刺激葡萄糖轉運蛋白1從細胞質轉移到細胞膜，促進葡萄糖攝取。(2)激活胰島素受體/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路，增加葡萄糖6磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表達，減少葡萄糖生成[5]。在筆者的研究中顯示(未發表數據)，二氫楊梅素治療后小鼠體脂含量減少，同時棕色和腹股溝皮下脂肪中的解耦聯蛋白1表達明顯升高，提示二氫楊梅素可激活棕色脂肪和米色脂肪。棕色脂肪和米色脂肪由于富含線粒體以及解耦聯蛋白1，在寒冷、交感神經系統興奮以及藥物刺激情況下，可燃燒脂滴，將能量以熱能的形式釋放出去，而被稱為產熱脂肪。激活產熱脂肪可增加能量消耗，降低體重，增加胰島素敏感性，改善糖代謝[6]。同時產熱脂肪的激活也可促進甘油三酯的代謝，降低血漿甘油三酯水平[7]。

肝細胞中甘油三酯的過度蓄積是NAFLD的顯著特征和起始步驟[8]。肝臟甘油三酯代謝與肝臟脂質從頭合成以及脂肪酸氧化分解密切相關[9]。SREBP-1c是調節肝臟脂質從頭合成途徑最重要的轉錄因子，可特異性調節脂質從頭合成途徑中很多關鍵酶的表達，如FASN、ACC1、SCD1等。研究顯示，高脂飲食誘導的NAFLD小鼠肝臟中SREBP-1c表達明顯上調，短期抑制SREBP-1c表達可以逆轉由飲食誘導的NAFLD[10]。FASN是脂肪酸合成的限速酶，抑制FASN的表達可以減少脂肪酸的合成，改善肥胖引起的NAFLD[11]。本研究結果顯示，二氫楊梅素可下調SREBP-1c及其下游與脂質從頭合成密切相關的FASN蛋白的表達水平，提示二氫楊梅素可通過抑制脂質從頭合成途徑來減少脂肪酸的合成，從而改善NAFLD。SREBP-1c的表達受胰島素、AMPK、肝X受體(LXR)、脂肪因子等多種因素的調控[12-15]。有文獻報道，二甲雙胍等AMPK激活劑可通過抑制SREBP-1c表達，改善脂肪肝[16]。既往研究顯示，二氫楊梅素具有激活骨骼肌中AMPK信號通路的作用，提示二氫楊梅素可能通過激活肝臟中AMPK來抑制SREBP-1c表達[17]。此外，也有研究證實，棕色脂肪分泌的脂肪因子神經調節蛋白4(Nrg4)可通過激活肝細胞中的表皮生長因子受體3(ErbB3)和表皮生長因子受體4(ErbB4)信號通路，抑制SREBP-1c的表達，改善脂肪肝[15]。而筆者研究發現二氫楊梅素可激活棕色脂肪，提示二氫楊梅素也可能是通過作用于棕色脂肪，促進Nrg4分泌并激活其下游信號通路來調控SREBP-1c表達的。當然，二氫楊梅素究竟是通過何種途徑調節SREBP-1c表達的，目前還不清楚，仍需要進一步的研究。NAFLD的實質是甘油三酯在肝細胞內的過度沉積。肝臟甘油三酯的生成和分解都是影響其含量的主要因素。本研究還檢測了與脂肪酸β氧化相關的基因如PPARα、MCAD、ACOX、CPT1等的表達，結果發現，二氫楊梅素處理之后上述基因表達無明顯變化。但Guo等[18]研究顯示，NAFLD大鼠經尾靜脈注射二氫楊梅素12周后，肝臟PPARα蛋白和mRNA水平表達均明顯上調，提示二氫楊梅素治療后大鼠肝臟組織脂肪酸氧化分解增強。此研究結果與筆者的結果不一致，推測可能與實驗動物物種不同有關，或者是由于給藥時間長短不同所致。

血清AST和ALT是肝細胞損傷的重要生化指標，當肝功能發生損傷時，血清中的AST和ALT水平升高。NAFLD時，肝臟中的脂質沉積、炎性反應和肝細胞凋亡均可引起肝細胞損傷。本研究結果顯示，二氫楊梅素可通過抑制肝臟脂質沉積，減少肝細胞損傷。但也有研究發現，二氫楊梅素可以通過抑制核因子-κB的激活，減少白細胞介素-6、白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等炎性因子的釋放，減輕高脂飲食對小鼠肝臟造成的炎性損傷；通過抑制核因子-κB/p53/Bax信號通路，減少肝細胞凋亡，保護肝功能[18]。本研究所發現的小鼠血清AST和ALT水平降低，可能是二氫楊梅素通過多個機制改善了肝功能的結果。

綜上所述，本研究表明二氫楊梅素不僅可以降低高脂飲食誘導的NAFLD小鼠體重，改善其糖脂代謝，而且可以改善肝功能，降低肝臟中脂質沉積，進而發揮對NAFLD的改善作用。此外，二氫楊梅素通過降低SREBP-1c/FASN的表達，抑制肝臟脂質從頭合成途徑，減少肝臟脂質合成，這可能是其改善NAFLD的重要機制之一。