地中海貧血實驗室篩查和診斷方法進展與評價

鄭慕陽

（廣西壯族自治區江濱醫院，廣西 南寧 530021）

地中海貧血為臨床常見的血液系統疾病，屬隱性遺傳性血液疾病的一種，由構成紅血球基因失常所導致。根據基因受累情況的不同，可將地中海貧血分為α型與β型兩種。該疾病包括輕度、中度、重度三種。輕度地中海貧血患者，一般無明顯癥狀，部分患者偶爾可感到體力下降。隨著病情的加重，癥狀逐漸明顯，嚴重甚至可導致壽命縮短。如夫妻雙方均為同型基因攜帶者，胎兒罹患重癥地中海貧血的幾率為25%左右，疾病目前尚無有效的治療方法，因此，積極給予預防是關鍵。臨床研究發現，地中海貧血的發生，與遺傳以及基因因素有關。在我國，廣東及廣西地區人群以客家人為主，兩地區為地中海貧血的高發區域。及早篩查并診斷，可實現對疾病的預防與控制，對我國新生人口質量的提升，具有積極意義。為達到上述目的，全面改善居民的健康狀況，本文對地中海貧血實驗室篩查和診斷方法進展進行了總結與評價。

1 地中海貧血實驗室篩查方法

地中海貧血實驗室篩查方法，包括紅細胞滲透脆性實驗、血紅蛋白組分分析、血常規篩查方法三種，三者的原理、優勢與缺陷，主要體現在以下方面。

1.1 紅細胞滲透脆性實驗 采用紅細胞滲透脆性實驗篩查地中海貧血，效果值得肯定[1]。該實驗原理在于利用紅細胞的滲透特征，觀察血液標本有無異常[2]。臨床研究發現，地中海貧血患者中，90%以上者均伴有紅細胞脆性下降現象，脆性低的紅細胞，進入低滲鹽水溶液中，可發生膨脹，繼而破裂[3]。因此，實驗中，如發現紅細胞膨脹破裂，則可判斷患者可能伴有地中海貧血[4]。該篩查方法的優勢，在于簡單便利，但特異性低，部分肝病患者，血液標本檢查時同樣可見該現象[5]。

1.2 血紅蛋白組分分析 血紅蛋白組分分析，同樣為臨床用于篩查地中海貧血的主要手段。最初，淀粉膠電泳-濾紙電泳，為血紅蛋白組分分析的關鍵技術，但該技術篩查方法不盡人意[6]。隨著醫療衛生技術的發展，醋酸纖維膜電泳法出現，雖提高了檢出率，但假陽性率較高，且具有分辨率低的缺陷。目前，臨床所應用的血紅蛋白組分分析方法，以高效液相色譜法為主[7]。該方法具有精確度高、操作簡單的優勢，且有助于分辨主要變異體，但因檢測成本高，故難以在所有醫院普及[8]。

1.3 血常規篩查方法 血常規檢測，具有便利、簡單、成本低廉的優勢，臨床常采用該方法篩查地中海貧血[9]。采用該方法篩查疾病，臨床需對HGB、MCV以及MCH、PLT等項目數值進行觀察。地中海貧血患者，往往可見MCV水平下降（一般為82 g/L以下）、MCH水平下降（一般為27 pg以下）[10]。但需注意的是，部分缺鐵性貧血患者，血常規檢測同樣可見上述現象。因此，建議臨床結合血清鐵等指標，輔助篩查疾病，以免發生誤診，對患者疾病的治療造成延誤[11]。

2 地中海貧血實驗室診斷方法

本部分主要歸納了ARMS、PCR、PCR-SSCP、PCRRFLP、PCR-RDB、熒光定量PCR以及ASO技術等地中海貧血實驗室診斷方法的特點與應用方法，并對其優勢及缺陷進行了對比。

2.1 ARMS ARMS為臨床診斷地中海貧血的常用方法，又稱多重擴增阻滯突變系統。臨床研究發現，該方法診斷的準確率，與反應條件的變化有關[12]。為解決上述問題，部分學者指出，可將甲酰胺加入反應過程中。臨床實驗表明，采用ARMS診斷地中海貧血，設計4條引物，可實現對HbCS以及HbQS的擴增，判斷兩者是否存在突變，提高疾病檢出率[13]。ARMS技術，具有檢測便利性強的特點，且效率較高。目前，該方法已被廣泛應用到了臨床，并發揮了巨大的價值[14]。另外，采用ARMS技術診斷時，臨床僅需提取患者微量DNA樣本，便可有效檢測，實驗設計較為簡單，無需對分子進行雜交，無需對放射性核素進行觀察，此為ARMS技術的主要優勢。該技術用于診斷地中海貧血，同樣具有一定的缺陷，主要體現在特異性低方面，診斷時，易出現假陽性與假陰性問題，可能發生誤診或漏診。

2.2 PCR PCR又稱聚合酶鏈式反應，強調利用DNA聚合酶的功能，作用于成對引物，使兩者的特異性DNA片段得到催化，從而達到體外擴增的目的[15]。有學者在研究中指出，該診斷方法的應用，雖可取得較好的效果，但如將其與OR法結合，則可更加準確的檢出基因突變型，進一步提升地中海貧血陽性率[16]。熒光PCR為近年來出現的地中海貧血診斷技術，與普通PCR相比，敏感度可高出1000倍以上，實現對正?；?、雜合子、純合子的辨別。目前，熒光PCR在國內各大醫院已有所應用。通過對胎兒羊水或臍帶血的檢測，可及早發現地中海貧血發生的風險。

2.3 PCR-SSCP PCR-SSCP又稱聚合酶鏈式反應-單鏈接構象多態性分析，與PCR法相比，該方法要求在DNA體外擴增后，給予單鏈DNA多態性分析[17]。采用該方法診斷，有助于供臨床掌握患者的突變情況。近些年來，測序技術已出現并被應用到了臨床，故PCR-SSCP法在地中海貧血診斷中的應用頻率逐漸下降。PCR-SSCP診斷地中海貧血，優勢在于無放射性核素污染，安全性較強，且有助于使臨床及早發現未知點突變。此診斷方法的缺陷在于，對PCR產物的要求較高，如產物＜200 bp，則突變檢出率一般為70%-90%。臨床可根據該方法的特點，對其進行選擇。針對產物＞200 bp者，可考慮選擇PCR-SSCP法診斷。

2.4 PCR-RFLP PCR-RFLP又稱聚合酶鏈式反應-限制性內切酶酶譜檢測，強調于DNA體外擴增后，對其內切酶進行消化，繼而通過電泳的方式，判斷基因有無突變。該診斷方法的優勢，主要體現在操作較為簡單方面。采用PCR-RFLP診斷地中海貧血時，如用于檢測小片段缺失及內切酶點改變，效果較好[18]。但單獨采用該技術診斷，無法直接測出基因突變型，需聯合使用探針，方可最終確診?？梢?，此法診斷地中海貧血，具有一定的局限性，難以推廣應用。因此，目前聚合酶鏈式反應-限制性內切酶酶譜檢測法在臨床的應用較少。

2.5 PCR-RDB PCR-RDB又稱聚合酶鏈式反應-寡核苷酸探針反向斑點雜交，要求利用探針，對DNA進行提取，在此基礎上，通過一次性雜交的方式，觀察有無基因突變。PCRRDB診斷的優勢，在于敏感性強，用于診斷地中海貧血，檢出率較高。另外，該方法同樣不同于傳統雜交法，可單次實現對多種突變進行的檢測，便利性強。PCR-RDB診斷方法的缺陷，主要體現在存在假陰性風險方面，易導致漏診[19]。臨床同樣發現，PCR-RDB僅可實現對已知位點基因突變的診斷，如突變基因位于未知位點，則不建議采用該方法診斷。因此，為提高地中海貧血的檢出率，臨床仍需對此方法進行謹慎選擇，降低漏診率，對患者的健康負責。

2.6 熒光定量PCR 熒光定量PCR，為PCR技術的一種，要求于體外環境下，對一對引物進行催化。與PCR相同，該方法同樣可實現對基因的體外擴增，從而供臨床判斷患者的DNA基因表達情況。地中海貧血患者，多伴有部分基因缺失，而大部分研究均發現，α-珠蛋白基因，為缺失基因的常見類型[20]。采用熒光定量PCR對疾病進行診斷，有助于及早發現異常，從而及早采取措施控制病情，改善患者的健康狀況。 但該診斷方法，同樣存在缺陷。如選取的相對定量與標準曲線存在局限性，診斷結果可能出現誤差，增加漏診以及誤診發生的可能。

2.7 ASO ASO技術又稱探針斑點雜交技術，該技術要求獲取PCR擴增產物，后將其點于尼龍膜上，繼而對基因進行區分，將其分為突變與正常兩種。臨床研究發現，采用該技術診斷地中海貧血，能夠對正常與突變的ASO進行鑒別，并使兩者雜交。探針不完全互補的情況下，如條件允許，具有完全洗脫的可能。此時，觀察雜交結果，便可實現對地中海貧血的診斷。該診斷方法，優勢，主要體現在假陰性與假陽性均較低、特異性高方面。另外，采用ASO法診斷疾病，同樣具有靈敏度高、檢測便利性強以及檢查結果獲取速度快的優勢，臨床可對其進行應用。但該診斷方法，同樣具有一定的缺陷，具體體現在對DNA純度與數量要求高、存在放射性污染方面。每次雜交僅能夠實現對一種突變的檢測。地中海貧血中，β型具有異質性高的特點，采用ASO法診斷時，需頻繁對探針進行更換，方可確診疾病。

綜上所述，采用紅細胞滲透脆性實驗、血紅蛋白組分分析等方法，對地中海貧血進行篩查，可及時發現疾病發生的風險。但根據篩查方法的不同，其優勢與缺陷同樣存在差異。臨床可根據醫院的條件，以及患者的需求，對不同篩查方法進行選擇，及早發現地中海貧血的風險。單獨采用上述方法篩查，難以確診地中海貧血。因此，臨床還需在此基礎上，利用ARMS、PCR、PCR-SSCP等方法診斷，則可提高疾病檢出率。臨床應加強對各類診斷方法的點的重視，與此同時，將篩查與基因診斷法結合，全面提升地中海貧血的檢出率，為居民健康狀況的改善提供保證。此外，還需重點對廣東、廣西兩省孕婦進行篩查，如發現胎兒存在罹患地中海貧血的風險，需考慮及早采取措施干預，或考慮引產，提升我國新生人口質量。