香菇煮菇水木瓜蛋白酶酶解增鮮技術研究

李順峰 劉麗娜 王安建 田廣瑞 許方方

(河南省農業科學院農副產品加工研究中心，河南 鄭州 450002)

香菇(Lentinusedodes)是傘菌目口蘑科一種藥食兩用的真菌，因含有多糖、多酚、小分子肽以及膳食纖維等活性成分[1-3]而具有抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等保健作用[4-6]，還含有豐富的5′-核苷酸和谷氨酸、天冬氨酸等呈鮮味氨基酸而呈現出鮮美的味道[7]。據中國食用菌協會統計[8]，2017年中國香菇產量為986.51萬t，而河南省香菇產量為280.5萬t，占全國香菇年產量的28.43%，位列全國第一。目前，香菇除了干制和鮮銷以外，有將近30%的香菇用于加工，而在加工過程中燙漂是必需的工序，產生大量煮菇水(約800～1 400萬t)，這些煮菇水含有大量水溶性營養成分等。如能將這些營養成分和呈味成分進行提取利用，制成保健食品、調味品等，不僅能提高企業的效益，還可以減少對環境的污染。

目前，對食用菌煮菇水的研究甚少，常樹人[9]將煮平菇水用于制作平菇母種培養基，俞智明[10]利用煮菇水制備醬油。而對食用菌煮菇水的營養成分和呈味成分構成及其產品開發尚缺乏研究。另有不同溫度處理對香菇香氣成分變化方面的報道[11-12]，而對香菇煮菇水的利用研究鮮見報道。研究[13-14]表明，采用酶法得到的蛋白酶解液含有豐富的呈味氨基酸、呈味肽等呈味成分，已成為制備高檔復合調味品的重要基料。試驗擬以香菇煮菇水為研究對象，采用生物酶解技術提高其呈鮮味物質含量，增強風味，以期為香菇煮菇水的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

香菇煮菇水(干物質2.58 g/100 mL，其中蛋白質0.43 g/100 mL，總糖0.54 g/100 mL)：河南天中億龍食品有限公司，經紗布過濾后備用。

1.1.2 試劑

5'-磷酸二酯酶：食品級，酶活1萬U/g，南寧龐博生物工程有限公司；

磷酸二氫鉀、四水合鉬酸銨、高碘酸鈉、乙酰丙酮、乙二醇、抗壞血酸、乙酸鈉、乙酸等：國產分析純；

5'-腺苷酸(5'-AMP)、5'-鳥苷酸(5'-GMP)、5'-肌苷酸(5'-IMP)：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；

5'-黃苷酸(5'-XMP)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

試驗用水為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設備

分析天平：FA2004C型，上海越平科學儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-98AB型，上海一恒科學儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司；

旋轉蒸發儀：RV8V-C型，德國IKA集團；

恒溫磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限公司；

艾柯超純水機：Exceed-Bc-16型，成都康寧實驗專用純水設備廠；

臺式高速冷凍離心機：H2050R型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，美國戴安公司。

1.2 方法

1.2.1 氨基酸態氮的定量測定 采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》第二法比色法。精密吸取0.1 mg/mL氨氮標準使用溶液0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL(相當于NH3-N 0，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 μg)分別于10 mL比色管中，向各比色管分別加入4 mL乙酸鈉—乙酸緩沖液(pH 4.8)及4 mL顯色劑(15 mL 37%甲醛與7.8 mL乙酰丙酮混合，加水稀釋至100 mL，劇烈振搖混勻)，用水稀釋至刻度，混勻。置于100 ℃水浴中加熱15 min，取出，水浴冷卻至室溫后，移入1 cm比色皿內，以0管為參比，于波長400 nm處測量吸光度，繪制標準曲線或計算線性回歸方程，回歸方程為：y=0.861 6x-0.01(R2=0.999 0)。

1.2.2 木瓜蛋白酶酶解單因素試驗 香菇煮菇水濃縮至原體積的1/2，取100 mL于三角瓶中，在加酶量0.20%、酶解時間3 h、酶解溫度50 ℃條件下，分別采用不同的pH (5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)進行酶解；在酶解時間3 h、pH 6.5、酶解溫度50 ℃條件下，分別采用不同加酶量(0.05%，0.10%，0.20%，0.30%，0.40%)進行酶解；在加酶量0.30%、pH 6.5、酶解溫度50 ℃條件下分別酶解1，2，3，4，5 h；在加酶量0.30%、酶解時間4 h、pH 6.5條件下，采用不同溫度(40，45，50，55，60 ℃)進行酶解，按照1.2.1方法將氨氮標準使用溶液替換為樣品溶液進行氨基酸態氮含量的測定，考察木瓜蛋白酶不同酶解條件對香菇煮菇水中氨基酸態氮含量的影響。

1.2.3 木瓜蛋白酶酶解正交試驗 在單因素試驗的基礎上，對加酶量、酶解時間、pH值和酶解溫度4個因素分別選取3個水平，對酶解工藝進行優化。

1.2.4 呈鮮味氨基酸、呈鮮味核苷酸的測定

(1) 呈鮮氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)含量：按GB 5009.124—2016執行。

(2) 呈鮮味核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黃苷一磷酸(5′-XMP)]含量：酶解前后香菇煮菇水經4 000 r/min離心10 min后，上清液過0.45 μm濾膜后進行HPLC分析[1, 15]。

1.2.5 等效鮮味濃度(EUC)計算 EUC值常用來表征食品的鮮味程度[16]，具體指：在100 g的食物中，以谷氨酸鈉(MSG)的量來表示呈鮮物質的總量，其值按式(1)計算：

Y=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj)，

(1)

式中：

Y——EUC值，g MSG/100 mL；

ai——呈鮮氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)的含量，g/100 mL；

aj——呈鮮核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鳥苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黃苷一磷酸(5′-XMP)]的含量，g/100 mL；

bi——呈鮮氨基酸相對MSG的鮮味程度值(谷氨酸為1，天冬氨酸為0.077)；

bj——呈味核苷酸相對5′-IMP的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18)；

1 218——協同作用常數。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次，測定結果以平均值±標準差表示，數據分析與整理采用SPSS軟件和Excel軟件，采用Origin 9.6作圖。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解單因素試驗

2.1.1 pH值對氨基酸態氮含量的影響 由圖1可知，在試驗范圍內，隨著pH的升高，氨基酸態氮含量逐漸升高，在pH 6.5時，氨基酸態氮含量達到最大0.43 g/100 mL，隨著pH的繼續增大，氨基酸態氮含量呈逐漸下降的趨勢。這一結果與李順峰等[17]和鄭炯等[18]的研究趨勢一致。這可能是由于在較適的pH范圍內，酶的活性比較高，酶的水解作用有很大增強；而偏離了較適pH作用范圍，影響了底物的空間構象，從而影響了酶與底物的結合。故選擇pH 6.5作為較適宜酶解pH。

圖1 酶解pH對氨基酸態氮含量的影響

2.1.2 木瓜蛋白酶加酶量對氨基酸態氮含量的影響 由圖2可知，當加酶量由0.05%增加到0.30%時，氨基酸態氮含量由0.41 g/100 mL顯著升高至0.50 g/100 mL，然后再繼續增加加酶量，氨基酸態氮含量呈緩慢升高趨勢，與加酶量為0.30%時相比，氨基酸態氮含量均未達到顯著水平(P>0.05)，當加酶量增至0.40%時，氨基酸態氮含量僅比加酶量為0.30%時增加了0.002 g/100 mL，考慮后續工作和節約資源等綜合因素，選擇加酶量0.30%較為合適。

圖2 加酶量對氨基酸態氮含量的影響

2.1.3 酶解時間對氨基酸態氮含量的影響 由圖3可知，酶解時間在1～4 h，隨著酶解時間的增加氨基酸態氮含量逐漸升高，酶解時間在4 h時，氨基酸態氮含量達到最大，隨著酶解時間的延長，氨基酸態氮含量不再增加。這是由于隨著酶解時間的延長，酶與底物充分接觸，反應速度加快，促進了酶解反應的發生，使氨基酸態氮含量持續增加；當催化反應速度達到最大時，繼續延長酶解時間并不能促進酶解反應的發生，故氨基酸態氮含量不再增加[19-22]。因此酶解時間確定為4 h。

圖3 酶解時間對氨基酸態氮含量的影響

2.1.4 酶解溫度對氨基酸態氮含量的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，氨基酸態氮含量逐漸升高，并在酶解溫度為50 ℃時，氨基酸態氮含量達到較高水平(0.51 g/100 mL)，隨后繼續升高溫度，氨基酸態氮含量則逐漸降低。這一趨勢與Pan等[19]報道的采用纖維素酶提取大蒜多糖的趨勢相一致。這可能是由于酶在較適的溫度下有較高的酶活，催化反應速度快；而偏離(低于或高于)較適作用溫度后酶的活性受到部分抑制或變性而失去活性[19-22]。因此酶解溫度確定為50 ℃。

圖4 酶解溫度對氨基酸態氮含量的影響

2.2 木瓜蛋白酶酶解工藝正交試驗優化

以氨基酸態氮含量為指標，對香菇煮菇水中氨基酸態氮的木瓜蛋白酶酶解工藝進行優化。正交試驗水平設計見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素與水平表

表2 正交試驗設計及結果

由表2可知，各因素對氨基酸態氮含量影響大小依次為C>A>D>B，木瓜蛋白酶酶解提高煮菇水中氨基酸態氮含量的最佳工藝組合為A1B3C3D3，即酶解 pH 6.0、酶解溫度55 ℃、加酶量0.40%、酶解時間5 h。此最優條件為表2中第3組試驗，其氨基酸態氮含量為0.454 g/100 mL。這一結果高于課題組[17]采用中性蛋白酶酶解香菇柄提取液的氨基態氮含量(0.046 g/100 mL)，可能與溶液中所含蛋白質含量和蛋白酶酶解能力有關。

2.3 木瓜蛋白酶酶解對香菇煮菇水鮮味的影響

由表3可知，木瓜蛋白酶酶解可顯著提高香菇煮菇水中呈鮮味氨基酸——谷氨酸和天冬氨酸含量(P<0.05)，而對呈鮮味核苷酸含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 酶解對香菇煮菇水鮮味成分的影響?g/100 mL

呈鮮味氨基酸與呈鮮味核苷酸存在協同效應，可以增加蘑菇的鮮味。Mau[23]將蘑菇中呈鮮成分的等效鮮味濃度(EUC)分為4級：一級>10.0 g MSG/g干物質，二級1.0～10.0 g MSG/g干物質，三級0.1～10.0 g MSG/g干物質，四級<0.1 g MSG/g干物質。按此標準，酶解前后香菇煮菇水的EUC均為二級(酶解前后EUC分別為5.47，7.34 g/g干物質)，但EUC從酶解前的27.371 g/100 mL顯著升高至36.683 g/100 mL。此結果高于Chen等[24]報道的香菇菌蓋的EUC(二級)為1.068～3.427 g/g，菌柄EUC(三級)為0.359～0.951 g/g和趙靜等[25]報道的香菇菌湯、酶解液和復水原液的EUC值分別為0.119，0.305，0.212 g/g 的結果。

3 結論

采用木瓜蛋白酶對香菇煮菇水進行酶解增鮮，經單因素試驗和正交優化試驗，得到木瓜蛋白酶酶解提高香菇煮菇水氨基酸態氮的最佳工藝條件為pH 6.0、酶解溫度55 ℃、加酶量0.40%、酶解時間5 h，氨基酸態氮含量為0.454 g/100 mL。香菇煮菇水經木瓜蛋白酶處理后可顯著提高呈鮮味氨基酸——谷氨酸和天冬氨酸含量，且經酶解后等效鮮味濃度顯著增強。酶解前后香菇煮菇水的等效鮮味濃度均為二級，仍需通過篩選不同酶、多酶協同作用等提高呈鮮味成分含量，進而增強鮮味。