水堿連續提取黃皮疣柄牛肝菌粗多糖的理化性質及抗氧化活性研究

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(1.滇西應用技術大學普洱茶學院,云南普洱 665000;2.普洱茶研究院,云南普洱 665000;3.云南農業大學食品科學技術學院,云南昆明 650201)

黃皮疣柄牛肝菌(Leccinellumcrocipodium(Letellier.)Watliag),子實體中等。菌蓋直徑4～7.5 cm,菌蓋邊緣幼時微內卷,呈土黃色、橘黃色、褐黃色,后期呈龜裂狀花紋,因此滇中地區又稱其為黃癩頭[1]。黃皮疣柄牛肝菌味道鮮美,富含蛋白質、膳食纖維、礦物質等營養成分[2-3]以及多糖、多酚等生物活性成分[4-5],深受人們的青睞。

水提多糖法是一種傳統的提取方法,因該提取方法無毒無害,且操作簡單成本低,適合大規模生產。目前對黃皮疣柄牛肝菌多糖的研究主要集中在熱水提取多糖上。岳萬松[6]研究發現,通過熱水法提取的黃皮疣柄牛肝菌多糖具有一定的抗氧化活性。常用的熱水提取法不能溶出胞內多糖和細胞壁結合多糖[7-8],堿性溶液在提取過程中能夠更好地破壞細胞壁中纖維素和半纖維素之間的氫鍵[9],使得不溶性多糖從細胞壁當中釋放出來,轉化為可溶性多糖。Khatua等[10]研究表明堿提紅菇粗多糖具有較好的抗氧化活性。熱水提取多糖后的殘渣未能得到充分利用便丟棄,既增加了環境的負擔,而且降低了開發利用的價值,研究表明[11-14],通過熱水提取多糖后剩余的殘渣,可以通過堿液提取進一步提取剩余多糖。為將黃皮疣柄牛肝菌中所含多糖提取最大化,本實驗先采用水提法,提取黃皮疣柄牛肝菌粗多糖,剩余殘渣;而后又采用堿提法對殘渣中的多糖進行提取,并且考察了兩種粗多糖的理化性質及抗氧化活性,為黃皮疣柄牛肝菌多糖的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃皮疣柄牛肝菌鮮菌 云南易門康源菌業有限公司;葡萄糖、氫氧化鈉、四硼酸鈉、硫酸鋇、明膠、硫酸鉀、無水碳酸鈉、無水乙醇、苯酚、抗壞血酸、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、氯化鐵、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 天津市風船化學試劑科技有限公司;鹽酸 西隴化工股份有限公司;濃硫酸 云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司;咔唑、D-半乳糖醛酸 山東西亞化學工業有限公司;三氯乙酸 天津市科密歐化學試劑有限公司;牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250 昆明杰輝生物有限公司;磷酸 成都市科龍化工試劑廠;沒食子酸 上海晶純生化科技股份有限公司;福林酚 北京索來寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) Sigma公司;所用試劑 均為分析純。

Heidolph Didital旋轉蒸發儀 德祥科技有限公司;FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;UV-2450型紫外分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;FST-PF-UP普利菲爾實驗室超純水機 上海富詩特儀器設備有限公司;HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;FW135型粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;Mettler-Toledo Pl1502型分析天平 上海微川精密儀器有限公司;Mettler-Toledo MS104TS分析天平 上海微川精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃皮疣柄牛肝菌粗多糖提取 將黃皮疣柄牛肝菌鮮菌除雜后清洗干凈切片,于-80 ℃預凍處理,放入冷凍干燥機進行真空升華干燥,然后打磨成粉過80目篩,真空包裝備用。采用水提醇沉法從黃皮疣柄牛肝菌子實體中提取得到水提粗多糖(LPS),再用堿提醇沉法從菌渣中提取得到堿提粗多糖(LPJ)。

水提粗多糖:采用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖:取適量凍干粉,按液料比34∶1 (mL/g)充分混勻,51 ℃下水浴3.1 h,提取液經4000 r/min離心10 min,沉淀備用。取上清液,50 ℃旋轉蒸發濃縮至原體積的1/5,冷卻后邊攪拌邊緩慢加入4倍體積濃縮液的無水乙醇,置于4 ℃冰箱靜置過夜。4000 r/min離心10 min棄上清,沉淀用適量去離子水溶解,于-80 ℃預凍處理,放入冷凍干燥機進行真空升華干燥。

堿提粗多糖[15-16]:水提后的黃皮疣柄牛肝菌殘渣用水浸洗后,按照20∶1的液料比用0.3 mol/L NaOH浸提2.5 h,4000 r/min離心10 min取上清,用0.5 mol/L HCl調至中性,在50 ℃下旋轉蒸發濃縮至原體積的1/5,冷卻后邊攪拌邊緩慢加入4倍體積濃縮液的無水乙醇,置于4 ℃冰箱靜置過夜。4000 r/min離心10 min棄上清,沉淀用適量去離子水溶解,于-80 ℃預凍處理,放入冷凍干燥機進行真空升華干燥。

1.2.2 黃皮疣柄牛肝菌粗多糖理化性質

1.2.2.1 多糖得率 水提粗多糖(LPS)稱重,計算得率。

堿提粗多糖(LPJ)稱重,計算得率。

1.2.2.2 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法[17]繪制葡萄糖標準曲線,回歸線性方程為y=0.0096x-0.0035,R2=0.9998,其中y代表490 nm波長下的吸光值A,x代表葡萄糖濃度(μg/mL)。

樣品測定,分別稱取一定量的LPS與LPJ,配制成濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液。離心取上清。平行三次測定吸光值。按照標準曲線回歸方程計算LPS與LPJ多糖含量。

1.2.2.3 糖醛酸含量測定 采用咔唑-硫酸比色法[18-20]繪制糖醛酸標準曲線,回歸線性方程為y=7.3957x+0.0005,R2=0.9988,其中y代表523 nm下的吸光值A,x代表糖醛酸濃度(mg/mL)。

樣品測定:精密稱取LPS與LPJ,分別配制成濃度為1 mg/mL的多糖溶液,平行三次測定吸光值,按照標準曲線回歸方程計算樣品中糖醛酸含量。

樣品測定:分別取LPS與LPJ,以1 mol/L的鹽酸配制成2.5 mg/mL的多糖溶液。于100 ℃水浴8 h,4000 r/min離心20 min取上清。平行三次測定吸光值,按照標準曲線回歸方程計算LPS與LPJ硫酸根含量。

1.2.2.5 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法(bradford法)[24-25]繪制蛋白質標準曲線,回歸線性方程為 y=0.0071x-0.0020,R2=0.9978,其中y代表595 nm下的吸光值A,x代表蛋白質標準溶液濃度(μg/mL)。

樣品測定:分別配制LPS與LPJ為0.1 mg/mL多糖溶液,平行三次測定吸光值,按照標準曲線回歸方程計算LPS與LPJ蛋白質含量。

1.2.2.6 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteau法[26-28]繪制總酚標準曲線,回歸線性方程為y=8.6886x+0.0046,R2=0.9996,其中y代表765 nm下的吸光值A,x代表沒食子酸標準溶液濃度(mg/mL)。

樣品測定:分別配制LPS與LPJ為0.1 mg/mL多糖溶液,平行三次測定吸光值,按照標準曲線回歸方程計算LPS與LPJ的總酚含量。

1.2.3 不同提取方法所得多糖體外抗氧化活性測定 通過測定LPS與LPJ清除DPPH自由基的能力、清除羥基自由基的能力、清除超氧陰離子自由基的能力、清除ABTS陽離子自由基的能力及還原能力,評價LPS與LPJ體外抗氧化活性。

1.2.3.1 清除DPPH自由基能力的測定 用去離子水溶解LPS與LPJ,分別配制LPS與LPJ為不同濃度的多糖樣品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL);配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的VC溶液。參照姜美云等[29-32]的方法,配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液,避光保存。將1 mL多糖樣品與2 mL DPPH-乙醇溶液漩渦混合后避光30 min,使其充分反應。分光光度計用無水乙醇調零,測定波長517 nm下的吸光值。平行測定三次,取平均值。DPPH自由基清除率計算公式如下:

其中,A1指多糖樣品與DPPH-乙醇混合溶液的吸光值;A2為多糖樣品溶液與不含DPPH的無水乙醇混合液的吸光值;A0為去離子水替代樣品溶液與DPPH-乙醇混合溶液的吸光值。VC溶液對DPPH自由基的清除同上,作為陽性對照。

1.2.3.2 清除羥基自由基能力的測定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照Gong等[31-33]的方法,將1 mL的多糖溶液與1 mL FeSO4(6 mmol/L),1 mL H2O2(6 mmol/L)混合,37 ℃孵育10 min,再加入1 mL 水楊酸-乙醇溶液(6 mmol/L)混勻,37 ℃孵育30 min。用分光光度計在510 nm下測定吸光值。平行測定三次,取平均值。羥基自由基清除率計算公式如下:

其中,A1指樣品與反應溶液混合的吸光值;A2為樣品與去離子水(替代H2O2)混合的吸光值;A0為去離子水替代樣品溶液與反應溶液混合的吸光值。VC溶液對羥基自由基的清除同上,作為陽性對照。

1.2.3.3 清除ABTS陽離子自由基能力的測定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照Yu等[30,34]的方法,7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸銨混合避光氧化12 h。ABTS混合液用pH=7.4的PBS稀釋至在734 nm波長下,吸光值為0.80±0.02。2 mL ABTS混合液與1 mL多糖樣品混合,室溫放置6 min,在734 nm波長下測吸光值。平行測定三次,取平均值。ABTS陽離子自由基清除率計算公式如下:

其中,A1指樣品與反應溶液混合的吸光值;A2為樣品與PBS(代替反應溶液)混合的吸光值;A0為去離子水(替代樣品溶液)與反應溶液混合的吸光值。VC溶液對ABTS陽離子自由基的清除同上,作為陽性對照。

1.2.3.4 清除超氧陰離子自由基能力的測定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照文獻[30-32]方法,采用NADH-NBT-PMS體系測定黃皮疣柄牛肝菌多糖清除超氧陰離子自由基能力,1 mL多糖樣品溶液與1 mL 557 μmol/L NaDH-Na、1 mL 45 μmol/L PMS、1 mL 108 μmol/L NBT混勻,于25 ℃下溫浴5 min,以去離子水進行調零。在波長510 nm下測定吸光值。平行測定三次,取平均值。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下:

其中,A1指樣品與反應溶液混合的吸光值;A2為樣品與去離子水(代替反應溶液)混合的吸光值;A0為去離子水(替代樣品溶液)與反應溶液混合的吸光值。VC溶液對超氧陰離子自由基的清除同上,作為陽性對照。

1.2.3.5 還原力的測定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照文獻[30-31]方法,1 mL多糖液與2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH=6.6)、2 mL鐵氰化鉀(1%)混合,在50 ℃下孵育20 min,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,在上清液中加入2 mL去離子水、0.4 mL 0.1%的氯化鐵溶液,在50 ℃下孵育10 min,在700 nm波長下測吸光值。平行測定三次,取平均值。

表1 LPS與LPJ的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of LPS and LPJ

1.3 數據處理

每個樣品設3個平行,所得結果以均數±標準差表示,采用GraphPad Prism 5作圖軟件和SPSS 19.0軟件進行數據統計分析及繪圖制作。

2 結果與分析

2.1 LPS與 LPJ

按照1.2.1的方法得到LPS與LPJ,如圖1所示。LPS呈海綿狀,顏色呈淺咖色;LPJ呈蓬松粉末狀,顏色呈黃褐色。LPS在50 ℃熱水中可溶解;LPJ在40 ℃熱水中即可溶解,LPJ相比LPS溶解性能好。

圖1 LPS與LPJFig.1 LPS and LPJ

2.2 LPS與LPJ得率及理化性質比較

如表1所示,LPS得率與LPJ得率相比差異顯著(P<0.05),說明相比堿提法,水提法能提取更多的黃皮疣柄牛肝菌多糖。此外,LPS多糖含量、糖醛酸含量、硫酸根含量、總酚含量顯著高于LPJ(P<0.05)。LPS與LPJ蛋白質含量差異不顯著(P>0.05),說明LPS和LPJ在提取過程中均含有大量蛋白質。

2.3 LPS與LPJ體外抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除DPPH自由基的能力如圖2所示,VC為陽性對照。LPS與LPJ均表現出一定清除DPPH自由基的能力,且表現出濃度依賴的特征。DPPH自由基清除率隨著LPS與LPJ的濃度增大而逐漸增大。當多糖濃度在4 mg/mL時,LPS、LPJ對DPPH自由基清除率分別為87.55%±0.51%、54.31%±2.72%,均低于VC對DPPH自由基清除率:96.84%±0.13%。LPS與LPJ的IC50值分別為0.217 mg/mL與3.158 mg/mL,LPS清除DPPH自由基的能力高于LPJ。

圖2 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of VC and the twopolysaccharides from Leccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.2 羥基自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除羥基自由基的能力如圖3所示,VC為陽性對照。在0～4 mg/mL濃度范圍內,隨著多糖濃度的升高,多糖清除羥基自由基的能力逐漸增強。陽性對照組VC的IC50值為0.284 mg/mL,LPS的IC50值為2.327 mg/mL。LPJ濃度為4 mg/mL時,對羥基自由基清除率小于50%,因此LPJ在所測試范圍內不能計算IC50值。當多糖濃度在4 mg/mL時,LPS、LPJ對羥基自由基清除率分別為54.53%±1.61%、46.50%±0.64%,均低于VC對羥基自由基清除率:98.71%±0.06%。LPS相比LPJ表現出較好的清除羥基自由基的能力。

圖3 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of VCand the twopolysaccharides from Leccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.3 ABTS陽離子自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除ABTS自由基的能力如圖4所示,VC為陽性對照。LPS與LPJ在0～4 mg/mL濃度范圍內,ABTS陽離子自由基清除率隨著濃度的不斷增加而增加,即ABTS陽離子自由基清除率與濃度呈依賴關系,LPS與LPJ的IC50值分別為0.413 mg/mL、1.081 mg/mL,均高于陽性對照組VC的0.074 mg/mL。當濃度為4 mg/mL時,LPS與LPJ對ABTS陽離子自由基清除率分別為81.56%±4.43%、68.79%±1.23%,均低于VC對ABTS陽離子自由基清除率。LPS與LPJ均具有一定的清除ABTS陽離子自由基的效果,且LPS優于LPJ。

圖4 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.4 ABTS cationic radical scavenging activity ofVC and the two polysaccharides fromLeccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.4 超氧陰離子自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除超氧陰離子自由基的能力如圖5所示,VC為陽性對照。LPS與LPJ在0～3 mg/mL濃度范圍內,超氧陰離子自由基清除率隨著濃度的不斷增加而增加,當濃度為3 mg/mL時,LPS與LPJ對超氧陰離子自由基清除率分別為89.16%±2.42%、85.94%±2.98%,均低于VC對超氧陰離子自由基清除率:99.19%±0.11%。當多糖濃度大于3 mg/mL時,LPS與LPJ清除能力有所下降。LPS與LPJ的IC50值分別為0.119、0.214 mg/mL,均高于陽性對照組VC的0.001 mg/mL。LPS與LPJ清除超氧陰離子自由基的趨勢相同,且在0～3 mg/mL濃度范圍內,LPS清除能力略高于LPJ。

圖5 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的超氧陰離子自由基清除能力Fig.5 Superoxide anion radical scavenging activity ofVC and the two polysaccharides fromLeccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.5 還原力測定 吸光值大小反映還原力高低,吸光值越大還原力越強。如圖6所示,LPS與LPJ還原力隨著濃度的不斷增加而增大,即還原力與濃度呈依賴關系。當LPS和LPJ濃度為4 mg/mL時,還原力吸光度值分別為1.41±0.02、1.16±0.01,LPS還原力與VC還原力1.41±0.003相當,LPJ還原力低于VC。這與LPS與LPJ的DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS陽離子自由基清除效果一致。

圖6 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的還原能力Fig.6 Reducing power of VCand the two polysaccharides fromLeccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

根據上述抗氧化指標分析可知,LPS相比LPJ抗氧化性較強,但均弱于陽性對照組VC。這可能是因為兩種提取方式多糖含量,糖醛酸含量與硫酸根含量存在差異所致,據文獻報道,多糖糖醛酸含量與自由基清除呈正相關[35];茶葉多糖中糖醛酸含量越高,抗氧化能力越強[36]。多糖中硫酸根的含量與其生物活性密切相關[37],而本實驗研究發現LPS多糖含量、糖醛酸與硫酸根含量均高于LPJ,因此,LPS的抗氧化活性優于LPJ。

3 結論

LPS與LPJ得率分別為18.44%±1.30%與5.50%±0.69%,LPS得率明顯高于LPJ。對LPS與LPJ理化性質進行研究,對比分析得出LPS多糖含量,糖醛酸含量,硫酸根含量均高于LPJ。LPS與LPJ抗氧化活性均隨著濃度的增加而逐漸增強,結合DPPH自由基、羥基自由基、ABTS陽離子自由基和超氧陰離子自由基清除率、IC50值以及還原力吸光度大小比較分析可知,LPS與LPJ均具有一定的抗氧化活性,且LPS強于LPJ。黃皮疣柄牛肝菌多糖有望開發為新的天然抗氧化劑。