以米糠、麩皮為基質的靈芝液態發酵動力學模型研究

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013)

靈芝生物活性成分復雜,現已從靈芝子實體、菌絲體和孢子中分離出279種具有藥理作用的活性物質,其中主要為多糖、三萜、多肽蛋白、生物堿、核苷等[1-2]。靈芝作為一種廣泛應用于中醫臨床的藥物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、調節血糖血脂、增強免疫力、保護神經等藥理作用[4-10]。靈芝子實體栽培周期長,易受環境、季節等因素影響,現較多采用發酵的方式獲得靈芝菌絲體,發酵周期更短,過程易控制,更符合工業化生產需求[11-12]。目前對于靈芝發酵的研究報道多關注于對發酵培養條件的優化,或對發酵產物的提取純化及結構功能等方面,而對發酵的過程研究較少[13-16]。

米糠、麩皮是水稻和小麥的加工副產物,米糠、麩皮在我國有著廣泛的來源,目前這種低廉原料多被用作飼料、發酵輔料或從中提取有利成分,其綜合利用率不足20%[17,23]。Souza等[24]在餅干配方中加入不同比例的米糠,得到纖維、γ-谷維素和葉黃素含量均更高的米糠餅干。Feng等[25]用土曲霉CICC40205突變體生物轉化麥麩,生產衣康酸。

靈芝作為一種白腐真菌,能產生多種木質纖維素降解酶,將復雜的木質纖維素底物降解為簡單的糖,并作為生物燃料加以利用[26]。本研究以一株誘變得到的發酵性能較優的靈芝菌株為研究對象,利用生物降解將米糠、麩皮用于生產價值更高的靈芝原料,并通過構建液態發酵過程中靈芝菌體生長動力學模型[27],深入了解靈芝液態發酵過程中菌體生長規律,為其工業化生產提供理論支持。將復雜的木質纖維素底物降解為簡單的糖,以產生未來的生物燃料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18 本課題組紫外誘變所得(保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏編號CCTCC NO:M 2018908);馬鈴薯 市售;米糠 粉碎后60目過篩,購于鎮江市丹徒區三山米廠;麩皮 粉碎后60目過篩,購于鎮江市丹徒區面粉加工廠;蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、瓊脂、葡萄糖、濃硫酸、苯酚等 均為分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司。

HVE-50高壓滅菌 上海賽默生物科技有限公司;SF-CJ-2AG凈化工作臺 上海三發科學儀器有限公司;HSX-150恒溫恒濕培養箱 上海海向儀器設備廠;HYL-C組合式搖床 太倉市強樂實驗設備有限公司;721G可見分光光度計 上海恒勤儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝發酵培養方法 在超凈工作臺中,從保藏的靈芝菌株固體斜面上,切割一個邊長為0.4 cm的正方形菌塊,將其轉接到準備好的PDA[14]平板上,28 ℃培養6 d。培養完成后,從平板上切割10個菌塊轉接至PD液體培養基中,120 r/min、28 ℃培養6 d可得種子液。再將種子液接種至發酵培養基中(按各因素水平參數設置進行配制),接種量10%,120 r/min、28 ℃培養7 d。

1.2.2 菌絲干重測定方法 發酵完成后,發酵液經60目網篩過濾,濾出物于50 ℃烘干至恒重稱重得到菌絲干重。

1.2.3 靈芝液態發酵菌絲體生長經驗動力學模型方程的研究 以培養基中米糠、麩皮、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂添加量和發酵時間為因素進行均勻試驗設計,同時將米糠和麩皮總量限定為10 g(每100 mL培養基中用量,下同),即將米糠和麩皮作為一個因素。以菌絲干重作為評價指標,利用SPSS線性回歸得到靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態發酵菌體生長經驗動力學模型方程。根據均勻試驗設計標準試驗次數須大于15,考慮到時間安排的合理性,采用U24(244)均勻設計進行發酵試驗。各因素范圍:米糠0.4～9.6 g、磷酸二氫鉀0.015～0.36 g、七水硫酸鎂0.015～0.36 g、時間0.5～12 d,共24個水平。

1.2.4 靈芝液態發酵菌體生長理論動力學模型方程的研究 Logistic模型曲線呈S型,能較好地反映微生物生長隨時間的變化規律,具有一定的適用性[17]。Logistic方程為:

式(1)

式中:Cx,0為初始菌絲體濃度,測得為0.208 g/100 mL;Cx,max為最大菌絲濃度,單位g/100 mL;μm為最大比生長速率,單位d-1;t為時間,單位d。

本研究所得的靈芝菌體生長經驗動力學方程是關于培養基各成分及發酵時間的函數方程,利用Excel對此方程進行計算可得到特定培養基條件下,菌絲干重隨時間變化的預測值。培養基條件設置采用U16(163)均勻試驗設計,各因素范圍:米糠0.6～9.6 g、磷酸二氫鉀0.02～0.32 g、七水硫酸鎂0.02～0.32 g,時間設置為1～12 d。用SPSS非線性回歸代入Logistc方程得到對應條件下參數μm和Cx,max的值,再進行線性回歸即可得到參數μm和Cx,max關于培養基各成分的表達式,將其代入Logistic方程即可得靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態發酵菌體生長理論動力學模型方程。

1.3 數據分析

利用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析,所有實驗數據均為三個平行樣品的平均值,結果表示為平均值±標準差。本研究中采用的均勻設計表均來自聯合國際學院https://uic.edu.hk//～isci/Uniform Design/table/Un_n%5es.html。

2 結果與分析

2.1 U24(244)均勻試驗結果

按表1實施U24(244)均勻試驗設計,發酵完成后測得菌絲干重結果如下:

表1 U24(244)均勻試驗參數控制表及試驗結果Table 1 Parameters control table andresults of uniform design U24(244)

在表1中菌絲干重是在不同米糠用量、磷酸二氫鉀用量、七水硫酸鎂用量和時間組合下進行發酵得到的結果,但各因素的影響無法以此說明,故利用SPSS進行后續分析,并構建動力學模型。

2.2 靈芝液態發酵菌絲體生長經驗動力學模型方程的構建

表4 回歸方程系數顯著性分析Table 4 The analysis of regression equation coefficient significance

SPSS線性回歸得到的靈芝液態發酵菌絲體生長經驗動力學模型方程為:

y=1.836+3.983x3+0.25x4-0.439x1x2-0.423x1x3+0.011x1x4+10.704x2x2-8.82x2x3-0.013x4x4

式(2)

表2 回歸方程擬合度分析Table 2 The analysis of regression equation fitting degree

表3 回歸方程顯著性分析Table 3 The analysis of regression equation significance

2.3 靈芝液態發酵菌絲體生長理論動力學模型方程的構建

將表6中的培養基條件參數代入式(2)得到菌絲干重在不同培養基條件下隨時間變化的預測值,單位為g/100 mL,結果見表5。

表5 不同培養基條件下菌絲干重的預測值Table 5 The predicted value of mycelia dry weight in different medium conditions

將表5中的時間和菌絲干重預測值代入式(1),通過SPSS非線性回歸得到不同培養基條件下Logistic模型方程參數μm和Cx,max估計值,結果見表6。不同培養基條件按U16(163)均勻試驗設計進行參數控制,見表6。

表6 U16(163)均勻試驗參數控制表及不同培養基條件下參數μm和Cx,max估計值Table 6 Parameters control table of uniform deignU16(163) and estimated values ofμm and Cx,max in different medium conditions

以x1、x2、x3及其二次項x1x1、x1x2、x1x3、x2x2、x2x3、x3x3為自變量,參數μm和Cx,max為因變量,利用SPSS線性回歸得到關于培養基各成分的回歸方程?；貧w方法選擇“向后”,設置使用F的概率“進入為0.05,刪除為0.1”。

表7 回歸方程擬合度分析Table 7 The analysis of regression equation fitting degree

表8 回歸方程顯著性分析Table 8 The analysis of regression equation significance

由表9可得參數μm的回歸方程為:

μm=3.283+0.104x1+3.51x3-0.025x1x1-0.612x1x2-0.418x1x3+10.101x2x2-7.229x2x3

式(3)

表9 回歸方程系數顯著性分析Table 9 The analysis of regression equation coefficient significance

表12 回歸方程系數顯著性分析Table 12 The analysis of regression equation coefficient significance

表10 回歸方程擬合度分析Table 10 The analysis of regression equation fitting degree

表11 回歸方程顯著性分析Table 11 The analysis of regression equation significance

由表12可得參數Cx,max的回歸方程為:

Cx,max=2.891+0.033x1+3.882x3+0.006x1x1-0.386x1x2-0.406x1x3+11.144x2x2-8.604x2x3

式(4)

將式(3)和式(4)代入式(1),即可得到靈芝液態發酵菌絲體生長理論動力學模型方程:

μm=3.283+0.104x1+3.51x3-0.025x1x1-0.612x1x2-0.418x1x3+10.101x2x2-7.229x2x3

Cx,max=2.891+0.033x1+3.882x3+0.006x1x1-0.386x1x2-0.406x1x3+11.144x2x2-8.604x2x3

式中:x1、x2和x3分別為發酵培養基中米糠、磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂的用量,單位g/100 mL;t為發酵時間,單位d。

在經驗和理論動力學模型方程中,x1直接或與其他項的交互作用顯著影響因變量,即培養基中米糠和麩皮用量的配比會影響發酵結果,原因可能是麩皮中總膳食纖維含量比米糠更高。有研究表明,靈芝優選木質纖維素含量高,且含氮量低的底物[28],因為靈芝生長代謝過程中會分泌木質纖維素降解酶,將底物中的木質纖維素降解成更易于吸收利用的營養物質,故可以認為麩皮比米糠更有利于靈芝菌體的生長繁殖,此結論與前期培養基優化試驗的結果一致。

2.4 靈芝菌絲體生長經驗與理論動力學模型的比較

將前期優化實驗得到的發酵培養基條件(米糠1 g/100 mL、麩皮9 g/100 mL、磷酸二氫鉀0.15 g/100 mL和七水硫酸鎂0.15 g/100 mL)代入靈芝Ganoderma lucidum JSU LIUYU18液態發酵菌體生長經驗動力學和理論動力學模型方程,在同一水平將兩模型方程與實測值進行比較，論證其可靠性。以發酵時間為橫坐標,菌絲干重為縱坐標,繪制菌絲體生長經驗動力學模型曲線和理論動力學模型曲線。

由圖1可知,在0～3 d經驗動力學模型曲線與理論動力學模型曲線相差較大,原因可能是在發酵初期,由于靈芝菌體進入新的培養基環境,此階段主要滿足菌體自身生長所需,底物消耗少,導致菌絲分離不徹底;同時絲狀真菌在生長初期會有一個快速生長期,此時期菌體的新陳代謝活躍,生長狀態變化較快,而兩個動力學模型均基于每12 h取一次樣的數據所得,導致其不足以反應靈芝菌株在快速生長期的變化,在第3 d后,兩模型的菌絲干重預測值基本一致。

表13 單因素方差分析結果Table 13 The results of one-way anova

圖1 經驗和理論動力學模型曲線Fig.1 The curve of empirical and theoretical dynamic model

將實測值、經驗動力學模型和理論動力學模型兩兩進行比較,結果如下:

由表13可知,將實測值、經驗動力學模型和理論動力學模型兩兩進行比較時,F均小于Fcrit,P均大于0.05,即三組數組間差異不顯著。表明經驗動力學模型和理論動力學模型與實測值之間沒有顯著差異,即得到的經驗和理論動力學模型能較好地反映靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18菌體的生長狀態。

3 結論

本研究通過U24(244)均勻試驗設計得到不同條件下靈芝發酵后的菌絲干重,并利用SPSS回歸分析得到靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態發酵菌體生長經驗動力學模型方程;本研究以Logistic方程為原型根據經驗動力學模型得到靈芝GanodermalucidumJSU LIUYU18液態發酵菌體生長理論動力學模型方程;通過比較兩模型與實測值,結果表明兩模型與實測值無顯著差異,即兩模型均能較好地反映發酵中靈芝菌體生長狀況,為其工業化生產提供理論指導。