微囊化釀酒酵母FMS115的高密度培養

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(1.南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2.江蘇省農業科學院農產品加工所,江蘇南京 210014;3.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一種真核模式生物,在發酵、醫藥、食品和生物等領域均具有十分廣泛的應用[1-3],因可以通過無氧呼吸將葡萄糖轉化為酒精,且耐高滲性能良好,尤其廣泛應用于發酵和釀造工業中[4],是人類最早利用的一類微生物。其營養成分十分豐富,含有菌體蛋白質、多種氨基酸、維生素、脂肪、食物纖維、礦物元素、微量元素等生理活性物質[5]。不僅活的酵母細胞可以發酵產酒精等香氣物質,為人類提供各色各樣的食品,死亡的酵母菌體內也因豐富的營養物質可用來做培養基等生物材料。在實際生產中,由于體積的限制和營養物質的消耗,酵母在培養一代左右即停止生長,因此解決酵母高密度培養的問題有助于實現以最少的投入獲得最大的利益。

細胞高密度培養(high-cell density cultivation,HCDC)是指在一定的培養條件下,在不影響胞內產物積累的基礎上,盡可能多地積累生物量[6]。常用的微生物高密度培養方法有恒定分批培養、補料流加培養、連續培養和細胞循環培養[7]。Eugene等[8]以補料分批培養的方式,采用合成培養基,獲得了140 g/L的最大干細胞生物量。王穎等[9]優化的培養基和培養條件最終使釀酒酵母細胞密度提高了22.0%。目前許多研究主要集中在培養條件的優化,無法解決代謝產物的抑制,由于發酵產業規模擴大,傳統菌體培養方式的缺陷凸顯,解決代謝產物的抑制比解決菌體生長的營養需求更加迫切[10]。本文擬對培養基和培養條件進行優化,在條件優化的基礎上,結合微膠囊技術和半連續補料培養方法,以解決產物的抑制作用,達到高密度培養的目的。

微膠囊是一種允許小分子營養物質自由進入和囊內代謝產物自由排出,同時阻止囊外生物大分子進入的物質,曾作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具[11-12]。早期研究是將海藻酸鈉滴入氯化鈣溶液中,形成海藻酸鈣固芯含菌膠囊,這種膠囊密度高,菌體主要生長在空隙和表面,空間效應不佳,生長量不高[13-14]。液芯膠囊在物質運輸方面更容易,細胞生長均勻,密度大[15],多用于乳酸菌的增殖培養[16]。酵母體積大,無氧呼吸產CO2,生長速度快,微膠囊易破裂,只能靜置培養,微膠囊化酵母培養的研究甚少。因此,本實驗擬將菌液與氯化鈣混合滴入海藻酸鈉溶液中,聚合形成液芯微膠囊,通過更換培養基,增加菌體密度。

酵母菌株FM-S-115發酵性能良好,耐糖性和耐酒精性強,是一株較為優質的釀酒酵母[17-18]。本實驗在培養基YPDB基礎上,將優化碳源及碳源含量、氮源及氮源含量四個因素;在培養條件上,將優化溫度、菌液接種量和培養基初始pH三個因素,確定影響最顯著的三個因素,設計正交試驗得出最適培養條件,最后將合適海藻酸鈉和氯化鈣質量濃度下制得的微膠囊包裹酵母在最適條件下靜置培養4代,達到高密度培養的目的,以期為酵母的高密度培養相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母FM-S-115 保存于江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):0.3%馬鈴薯浸粉、2.0%葡萄糖、1.4%瓊脂;酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養基(YPDB):1.0%蛋白胨、0.5%酵母浸出粉、2.0%葡萄糖;葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖 分析純,西隴科學股份有限公司;蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏 分析純,北京奧博星生物技術有限責任公司;海藻酸鈉、氯化鈣、黃原膠、殼聚糖 食品級,南京松冠生物科技有限公司。

UV-1600PC紫外分光光度計 上海美普達儀器有限公司;SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;TOMYSX500自動滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司;FE28pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHZ-DA冷凍恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司;JB-10磁力攪拌器 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將甘油管保存的菌種在無菌條件下接種到YPDB培養基中,28 ℃,150 r/min搖床培養;活化2～3代后作為菌液使用。

1.2.2 生長曲線測定 將預先活化好的菌液以3%的接種量接入YPDB培養基中,28 ℃,150 r/min搖床培養,培養時間為24 h。每隔2 h取一次樣,三組平行試驗,測定菌體的OD600,以時間為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制生長曲線。

1.2.3 單因素實驗 分別優化碳源及含量、氮源及含量、溫度、培養基pH和菌液接種量七個條件,每組實驗3個平行。由于處理條件不同,培養液的顏色有差別,為了減小培養液顏色的誤差,取1 mL菌液離心去上清液,加5 mL蒸餾水,測量稀釋5 倍下OD600,以菌體稀釋5倍下的OD600表示菌體密度,下同。

1.2.3.1 培養基優化 以YPDB為基礎培養基,分別以乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖取代碳源,含量2%,其余培養基成分不變,28 ℃,150 r/min,培養16 h,確定最適碳源;預實驗中,將碳源含量持續增加至14%,菌株生長量持續增加,參考此結果,設置碳源含量為14%、16%、18%、20%以及培養基本身的碳源含量2%,優化碳源含量。以蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏取代培養基中的氮源,含量1%,其余培養基成分不變,28 ℃,150 r/min,培養16 h,確定最適氮源;設置最適氮源含量為0%、1%、3%、5%和7%,優化氮源含量。

1.2.3.2 培養條件優化 以YPDB為培養基，分別設置溫度20、25、30、35 ℃，此時培養基初始pH6.7(pH自然)，菌液接種量為3%，優化培養溫度。設置培養液初始pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和pH6.7(pH自然)，此時溫度為28 ℃，菌液接種量為3%，優化培養基初始pH。設置菌液接種量1%、3%、5%、7%、9%、11%，此時培養基初始pH6.7(pH自然)，溫度為28 ℃，優化菌液接種量。

1.2.4 正交試驗 單因素實驗結果得出,溫度、培養液初始pH和碳源含量三個因素影響最顯著,借助正交設計助手Ⅱ軟件,采用三因素三水平L9(34)的正交設計實驗,確定最適合菌株生長的條件。正交試驗的因素和水平設計如表1所示。

表1 正交試驗的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 液芯微膠囊化酵母的制備

1.2.5.1 微膠囊制備 具體制備方法參考文獻[19],略作修改。將培養至對數期的酵母菌懸液8000 r/min,離心3 min取菌體,將菌體加入到0.3%黃原膠和氯化鈣的混合液中,混合均勻后,逐滴滴入勻速攪拌的海藻酸鈉溶液中,立即收集預膠囊,用無菌水沖洗數次后,轉入0.1%的殼聚糖溶液中成膜30 min,收集微膠囊,用無菌水徹底洗去殘留的殼聚糖,即制備完成。

1.2.5.2 海藻酸鈉質量濃度的確定 參考同類研究[20],配制質量濃度分別為0.8%、1.0%、1.2%和1.5%的海藻酸鈉溶液,此時氯化鈣質量濃度保持在7.0%,選擇破囊率最小時的濃度為合適的海藻酸鈉質量濃度。

1.2.5.3 氯化鈣質量濃度的確定 配制質量濃度分別為3.0%、5.0%、7.0%和9.0%的氯化鈣溶液,此時海藻酸鈉質量濃度保持在1.2%,選擇破囊率最小時的濃度為合適的氯化鈣質量濃度。

1.2.5.4 破囊率的計算

式(1)

1.2.6 微囊化酵母高密度培養 將合適的海藻酸鈉和氯化鈣質量濃度下制得的微囊化酵母置于最適培養條件下靜置培養,16 h后將膠囊過濾轉移到無菌新鮮培養基中繼續培養,取膠囊計活菌數,如此延續培養幾代,直至膠囊中活菌數不再升高時即為培養結束。

1.2.7 活菌總數的測定 培養基菌液活菌計數:用無菌生理鹽水梯度稀釋菌液,選擇10-4、10-5和10-6三個稀釋度的菌懸液100 μL于無菌培養皿中,再及時倒入融化且冷卻至45 ℃左右的YPDB培養基,立即充分搖勻,30 ℃條件下,培養24 h后菌落計數,將各平板中計得的菌落數的平均值換成單位容積的含菌量,再乘以相應的稀釋倍數,得出每毫升菌液的活菌數[22],即菌體密度,單位為CFU/mL。

囊內活菌計數:取培養結束的完整膠囊,微膠囊與破囊液1∶10搖晃至完全破碎,用無菌生理鹽水梯度稀釋,以下操作步驟同菌液活菌計數,單位為CFU/g。

破囊液[23]的制備方法:由0.20 mol/L NaHCO3和0.06 mol/L Na3C6H507·2H2O混合而成。

1.3 數據分析

實驗中的數據均為三組重復,用SAS V8分析顯著性差異,正交設計助手Ⅱ設計正交試驗,Origin 8.5繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母FM-S-115的生長曲線

釀酒酵母FM-S-115以YPDB為培養基,30 ℃,150 r/min培養24 h,其生長情況見圖1。由圖1可知,前8 h增長速度快,細胞活力高。在8～16 h內,增長速度降低,菌體密度逐步趨于穩定。16 h時菌體密度達到最高且不再增加,進入平穩期。對比竇冰然等[24]得出的面包酵母的生長曲線在24 h之后達到平穩期,此株釀酒酵母生長時間更短,在實際生產中優勢明顯?？紤]到穩定期內菌體互相競爭導致活性下降,選擇16 h為最佳培養時間。

圖1 菌株FM-S-115的生長曲線Fig.1 Growth curve of FM-S-115

2.2 培養基和培養條件優化

2.2.1 碳源種類對菌株FM-S-115生長量的影響 以乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖作為培養基碳源,考察不同碳源對菌體的生長情況的影響,結果見圖2?？梢钥闯?蔗糖和果糖均是優質的碳源,其中蔗糖的利用率最高(OD600=1.115)且差異顯著(P<0.05),其次是葡萄糖和麥芽糖,與朱作華等[25]對耐高溫、耐高糖的酒精酵母的條件優化中得出的實驗結果相同,實驗中選擇蔗糖為最適碳源。

圖2 碳源種類對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.2 Effect of carbon source on growth of FM-S-115注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖3～圖10同。

2.2.2 碳源含量對菌株FM-S-115生長量的影響 為考察菌株FM-S-115對碳源含量的耐受性,改變蔗糖含量為2%、14%、16%、18%和20%,結果如圖3。由圖3可知,蔗糖含量2%～20%的范圍內,OD值先升高后趨于平穩,在16%時最高,達到1.843,比2%蔗糖添加量對應的OD值1.142提高了40%,對比李飛龍等[26]研究得出的布拉氏酵母的最適葡萄糖含量在0.5 g/L的結果來說,此株酵母更耐糖且嗜糖。隨著蔗糖含量繼續增加,菌體密度呈現下降的趨勢,原因可能是細胞膜內外滲透壓不平衡,抑制了細胞的生長?？紤]到生產中碳源含量過高還會加速菌體生長,過早到達穩定期,不利于生產發酵,經方差分析蔗糖含量在16%、18%和20%下的結果無顯著性差異(P>0.05)的情況下,選擇16%為FM-S-115最適碳源含量。

圖3 碳源含量對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.3 Effect of carbon source contenton growth of FM-S-115

2.2.3 氮源種類對菌株FM-S-115生長量的影響 為考察不同氮源對酵母FM-S-115生長量的影響,選擇了蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏五種常見的有機氮源取代YPDB中的氮源培養酵母,結果見圖4?？梢钥闯?酵母FM-S-115對五種氮源均有較高的利用率,尤其是蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨和酵母粉,稀釋五倍下的OD值均大于1.1,且無顯著性差異(P>0.05),由于蛋白胨最為便宜易得,選為最適氮源。

圖4 氮源種類對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sourceon growth of FM-S-115

2.2.4 氮源含量對菌株FM-S-115生長量的影響 上述實驗得出最適氮源是蛋白胨,以YPDB為培養基,改變蛋白胨的含量為0%、1%、3%、5%和7%,觀察不同的蛋白胨含量對菌體生長的影響,結果見圖5?？梢钥闯?蛋白胨含量對菌體OD值的影響表現為先升高后減少,1%時OD值最大為1.057,濃度繼續增大OD值明顯降低,原因在于不適宜的氮源含量對菌體的生長和產物的表達合成都可能產生負面影響[27]?？紤]到實際發酵中會影響產物的合成,選擇1%為最適氮源含量。

圖5 氮源含量對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.5 Effect of nitrogen source contenton growth of FM-S-115

2.2.5 溫度對菌株FM-S-115生長量的影響 通過考察20、25、30、35 ℃四個溫度下菌株的長勢,選擇合適的發酵溫度,結果見圖6。由圖6可知,當培養溫度逐漸提高時,菌體的生長量先增加后降低,在30 ℃時達到最高,與趙小麗等[28]對釀酒酵母的高密度培養條件優化得出的最適培養溫度在30 ℃的研究結果一致。分析可知溫度的提高會加速細胞代謝,從而加速菌體生長,但是過高會降低酶活性,因此溫度高于30 ℃時,菌體密度逐漸降低。故實驗中選擇30 ℃為最適培養溫度。

圖6 溫度對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.6 Effect of temperature on growth of FM-S-115

2.2.6 培養液初始pH對菌株FM-S-115生長量的影響 菌株在培養基pH2～6.7范圍內的生長情況結果見圖7。如圖7所示,pH2.0～4.0時,酵母的生長量隨之增加,pH4.0時達到最高(OD600=0.941),大于4.0時對菌體的生長顯示出抑制作用,原因在于不適宜的pH環境影響菌體的生長代謝。此外,菌株在pH4.0～6.7的范圍OD值變化不大,說明此菌株有較寬廣的pH適應范圍。實驗中選擇菌體密度最大時的pH4.0為適宜培養基pH。

圖7 培養液初始pH對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.7 Effect of initial pH of mediumon growth of FM-S-115

2.2.7 菌液接種量對菌株FM-S-115生長量的影響 接種量大小對菌體生長的影響如圖8所示?？梢钥闯?接種量1%～7%范圍內,菌體密度隨之增加,在7%時最大(OD600=1.155),繼續增加接種量菌體密度下降,原因是接種量過低會延長發酵時間,過高會使得酵母之間互相競爭養分,過早到達衰退期。對比鄭苗等[29]對東方伊薩酵母研究得出2%接種量時菌體生長效果最佳的結果,此株釀酒酵母更能耐受較高的接種量。實驗中在5%～9%的范圍內無顯著差異(P>0.05)的情況下,為了菌體的活性以及發酵產物的積累考慮,選擇5%為該菌株的最適接種量。

圖8 菌液接種量對菌株FM-S-115生長量的影響Fig.8 Effect of inoculation amounton growth of FM-S-115

2.2.8 正交試驗結果 通過對比各個單因素實驗結果的菌體OD值增長幅度以及結合數據顯著性差異分析,可以得出三個影響最大的因素:溫度、培養液初始pH和碳源含量。正交試驗結果如表2所示。根據極差分析結果看出,三個因素之間影響最大的是溫度,其次是培養液初始pH,碳源含量影響最小。最優組合為A3B3C2,即溫度為32 ℃,pH為4.5,碳源含量為16%時,菌體稀釋5倍下的OD值最大,為1.471。對OD值分析,試驗號8和試驗號9的結果沒有顯著性差異(P>0.05),為選出最優組合對兩組培養基進行菌落計數。試驗號8的菌落總數為1.51×108CFU/mL,試驗號9為1.79×108CFU/mL,因此選擇試驗號9,即溫度為32 ℃,pH為4.5,蔗糖含量為16%為最佳培養條件,此條件下的菌落總數是優化之前液體培養(YPDB培養基,28 ℃、150 r/min,培養16 h,下同)菌落總數1.02×108CFU/mL的1.75倍。

表2 FM-S-115菌株條件優化正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test foroptimization of FM-S-115 cultivation conditions

2.3 微囊化酵母FM-S-115高密度培養結果

2.3.1 海藻酸鈉質量濃度的確定 海藻酸鈉質量濃度對培養一代后的膠囊破囊率的影響如圖9所示?？梢钥闯?在0.8%～1.5%的范圍內,破囊率先降低后升高,在1.2%時,破囊率最低,為14.89%。繼續升高海藻酸鈉質量濃度,破囊率升高,原因可能是海藻酸鈉濃度過低時,不能滿足鈣離子的配位需求,造成微膠囊孔隙過大,通透性大大增加,濃度過高時,配位數增加,空隙減小,膠囊的囊壁增厚,通透性降低,導致破囊率升高[19]。實驗中選擇制備微膠囊的海藻酸鈉質量濃度為1.2%。

圖9 海藻酸鈉質量濃度對破囊率的影響Fig.9 Effect of sodium alginateconcentration on capsule damage rate

圖10 氯化鈣質量濃度對破囊率的影響Fig.10 Effect of calcium chlorideconcentration on capsule damage rate

2.3.2 氯化鈣質量濃度的確定 氯化鈣質量濃度對培養一代后的破囊率的影響如圖10所示?？梢钥闯?3.0%～9.0%的范圍內,破囊率先降低后升高,7%時破囊率最低,為13%左右,濃度繼續增加,形成的膠囊通透性低,酵母的生長空間狹窄,導致破囊率升高。此外,酵母發酵過程中產氣也是一個重要原因。實驗中選擇制備微膠囊的氯化鈣質量濃度為7.0%。

2.3.3 微囊化酵母活菌計數結果 隨著更換培養基次數的增加,囊內活菌數的變化如圖11?？芍?培養至第4代菌落總數最大,到第5代時密度略降低,因為更換囊內菌體培養基次數增加,酵母老化,膠囊破碎,菌體流出,故確定培養代數為4代。培養結束時破囊計得囊內活菌總數為8.10×108CFU/g,是在優化前液體培養1.02×108CFU/mL的7.94倍,是優化后液體培養1.79×108CFU/mL的4.53倍,菌體密度得到大幅提升,達到了酵母高密度培養的目的。

圖11 培養代數對活菌計數的影響Fig.11 Influence of culture generations on colony count

3 結論

通過單因素和正交試驗實驗得出最適培養基為:1.0%蛋白胨,0.5%酵母浸出粉,16%蔗糖;最適培養條件為:溫度32 ℃、培養基初始pH4.5、菌液接種量5%,150 r/min培養16 h。在此條件下培養,酵母FM-S-115的活菌數為1.79×108CFU/mL,是優化前1.02×108CFU/mL的1.75倍。通過對液芯微膠囊制備過程海藻酸鈉和氯化鈣濃度優化,海藻酸鈉質量濃度為1.2%,氯化鈣質量濃度為7.0%時,破囊率最低。微囊化酵母在最適條件下連續培養,最終囊內活菌總數為8.10×108CFU/g,是培養條件優化前液體培養的7.94倍,是優化后液體培養的4.53倍,可見將微生物微膠囊化包埋后培養對提高生長量方面有很大意義。