超高壓與熱燙預處理對克氏原螯蝦肉凍藏品質的影響

喬 宇丁安子廖 李汪 蘭*

(1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所,湖北省農業科技創新中心農產品加工研究分中心,湖北武漢 430064;2.湖北工業大學生物工程與食品學院,湖北武漢 430068)

小龍蝦,學名克氏原鰲蝦(Procambarusciarkii),原產于美國中西部、墨西哥以及古巴,二十世紀三十年代由日本傳入我國南京,經過許多年的繁衍生長,目前克氏原螯蝦己成為我國長江中下游地區重要的淡水蝦類[1]。從小龍蝦產業發展報告[2]了解到，近十年來我國小龍蝦總產量迅速提升,己逐漸成為我國人民夏季餐桌上必不可少的美食之一。小龍蝦肉質鮮嫩、味道鮮美,具有高蛋白、低脂肪、低熱量的優點。而且蛋白中富含多種人體必需氨基酸,不但包括異亮氨酸、色氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、擷氨酸和蘇氨酸,而且還含有少量的精氨酸,營養價值極高[3]。因此延長貯藏期間克氏原螯蝦的品質,保證產品風味和安全顯得尤為重要。

克氏原螯蝦經過熱加工或超高壓(Ultra-high pressure processing,UHP)處理后不僅可以殺死有害微生物及鈍化酶活,還能獲得較完整的外觀,最大限度提高克氏原螯蝦的貯藏品質并延長其貨架期[4]。生蝦或熟透的對蝦在常溫下貯藏中會有發黑并發出哈喇味的現象[5]。而充分加熱會使克氏原螯蝦的肌肉蛋白質變性,使蝦肉質地得到一定改善。UHP技術是當前較火熱的一種食品非熱加工預處理方式。UHP技術是以水或其他流體為傳壓介質,使生物體內的化學鍵發生變化。研究表明UHP處理只對大分子(如蛋白質)的非共價鍵有顯著影響,對共價鍵無明顯影響,所以UHP處理后能最大限度地保留克氏原螯蝦的原有風味與營養價值。如:常耀光等[6]利用UHP有效殺滅南美白對蝦中的絕大多數微生物,抑制冷藏過程中揮發性鹽基氮的積累,延長了南美白對蝦的貨架期。同時,UHP處理能夠使蝦殼和肉之間的黏連組織蛋白發生變性,使得殼肉易于分離。汪蘭等[7]聯合UHP及熱燙輔助脫殼發現,UHP與熱燙聯合預處理對小龍蝦脫殼具有協同增效作用,300 MPa、1 min協同熱燙預處理后脫殼效率較熱燙提高 47.37%。王芝妍等[8]發現使用 200 MPa 壓力預處理鮮活中華管鞭蝦3 min 后,脫殼效果顯著提高,蝦仁結構完整,且生蝦肉相關質構值比直接剝殼組分別有所提高。熱燙作為一種廣泛使用的傳統預處理,不僅可以使酶鈍化、殺滅部分微生物,而且貯藏期間可以抑制營養物質、維生素的損失,保存樣品原有色澤、組織狀態、風味、滋味等[9]。目前,熱燙在果蔬、乳制品、罐頭食品等方面應用廣泛,且大多技術都已成熟,但其應用到水產品貯藏保鮮領域還鮮有報道研究,尤其在甲殼類動物上。

克氏原螯蝦是一類季節性很強的甲殼類動物。目前,比較不同預處理對克氏原螯蝦貯藏品質的影響相關報道較少。故本實驗對克氏原螯蝦進行熱燙(4 min)、超高壓(200 MPa,5 min)的預處理,置于-18 ℃凍藏,通過比較兩種處理對克氏原螯蝦凍藏過程中品質的影響,為兩種預處理對克氏原螯蝦在脫殼、貯藏、產品品質等方面提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活的克氏原鰲蝦(Procambarusciarkii) 購于湖北省武漢市白沙洲水產品批發市場;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 西隴化工股份有限公司;無水硫酸銅 Shanghai Macklin Biochemical Co.Ltd;醋酸、液體石蠟、氧化鎂、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍、氫氧化鉀、氯化鉀、尿素、鹽酸、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉、乙酸乙酯、2,4-二硝基苯肼、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉、順丁烯二酸、乙二胺四乙酸 國藥集團化學試劑有限公司;8-苯胺-1苯磺酸 源葉生物有限公司;牛血清蛋白、DTNB Biosharp;EGTA 飛揚生物有限公司;Tris、鹽酸胍 BioFroxx GmbH。

Ta.XT 2i/50質構儀 英國Stable Micro Ssytem公司;CR-400/410色彩色差 美能達投資有限公司;G2-B便攜式pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;722N可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;BC/BD-200HEF冰箱 青島海爾特種電冰柜有限公司;T18 basic均質機 德國IKA公司;HH-ZK2恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責任公司;實驗室pH計 FE20 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;3K15離心機 德國Sigma;CF15R高速低溫離心機 日本日立;F-4600日立熒光光譜儀 日本島津RF5301;L2-600 MPa/2 L超高壓預處理機 天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司;BS-210型電子天平 德國Sartorius Instruments有限公司;DZD-600/S2E真空包裝機 燕城神州食品機械(北京)有限公司;BS91便攜式電灶 佛山市順德區金奇電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 在4 ℃的冷庫中去除克氏原螯蝦的觸須、蝦鉗和蝦腳,并將處理后的克氏原螯蝦置于碎冰環境中放置備用。將處理后的克氏原螯蝦隨機分成3組(對照組、超高壓組、熱燙組),其中5尾/袋,分別進行如下預處理。對照組:克氏原螯蝦直接用聚乙烯薄膜袋真空包裝。熱燙組:克氏原螯蝦在沸水浴高溫加熱4 min后,置于冰水中,表面水用濾紙吸干后用聚乙烯薄膜袋真空包裝;超高壓組:克氏原螯蝦用聚乙烯薄膜袋真空包裝后,用超高壓裝置處理200 MPa、5 min。3組樣品預處理后共135袋,45袋/組,將所有樣品置于-18 ℃冰箱中貯藏,分別于0、4、8、12、24周測定各項指標。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照GB 5009.228-2016半微量定氮法進行[10]測定樣品的TVB-N值。

1.2.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)的測定 參考Salih等[11]的方法。稱取10 g蝦肉于凱氏蒸餾瓶中,加入20 mL去離子水攪勻,再加入2 mL鹽酸和液體石蠟,采用水蒸氣蒸餾,收集50 mL蒸餾液。取5 mL蒸餾液與5 mL TBA醋酸溶液于25 mL比色管中充分混勻,于100 ℃水浴35 min后冷卻10 min,在535 nm處測吸光度(A)。以去離子水取代蒸餾液為空白樣。

TBA(mg/g)=A×7.8×10-2

式(1)

1.2.2.3 pH測定 用pH標準校正緩沖液校正便攜式pH計,然后用蒸餾水沖洗探頭,用濾紙擦拭干凈,將便攜式pH計探頭插入蝦仁中,分別測定對照組、熱燙組、超高壓組樣品的pH。

1.2.2.4 水分的測定 參照GB 5009.3-2016[12]直接測定法測定樣品的水分含量

1.2.2.5 質構的測定 取克氏原螯蝦肌肉,利用質構儀對其進行質地多面分析(Texture profile analysis,TPA),測定其硬度、彈性、咀嚼性和粘著性。并將蝦仁置于質構儀P/36 R探頭下選取穿刺剪切力模式對樣品進行嫩度,蝦仁的放置方向保持與探頭方向垂直,測試條件為:測前速度:2 mm/s;測試速度:0.5 mm/s;測后速度:2 mm/s;測試深度(應變):5 mm;觸發力:5 g;計算值為20。導出所測數據,所有測試均有至少12個平行樣,取平均值。

1.2.2.6 色澤的測定 將蝦殼剝去,取蝦仁第一關節,用色差計測定樣品的顏色,將探頭垂直放在樣本第一關節肌肉上,測量并記錄L*、a*、b*值。

1.2.2.7 肌原纖維蛋白的提取 參考任麗娜[13]的方法,取3 g小龍蝦肉(去殼后蝦肉剁碎),加入10 倍體積以預冷過的Tris-馬來酸緩沖液(50 mmol/L KCL-20 mmol Tris-馬來酸,pH7.0),用均質機勻漿,低溫離心(9000 r/min,10 min,4 ℃)取出后棄去上清液,重復洗滌2次。所得沉淀與Tris-馬來酸緩沖液(0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸,pH7.0)用攪拌機勻漿,放入冰箱4 ℃提60 min,取出后低溫離心(9000 r/min,30 min,4 ℃),所得上清液為肌原纖維蛋白溶液。每組至少三個平行,其中熱燙組的肌原纖維蛋白提取未成功,故蛋白類指標只有對照組與超高壓組比較。

1.2.2.8 肌原纖維蛋白濃度測定 采用雙縮脲方法繪制蛋白濃度標準曲線:分別取6只試管,加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清蛋溶液(10 mg/mL),用蒸餾水定容至1 mL,然后分別加入4 mL雙縮脲試劑,于室溫下放置30 min,在560 nm下測吸光度。分別以濃度和吸光度值為X和Y軸,建立回歸方程y=0.2585x+0.0013(R2=0.9995)。

1.2.2.9 總巰基測定 參照董開成[14]方法,取1 mL肌原纖維蛋白樣品溶液(0.4%),加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(其中含8 mol/L尿素,10 mmol/L EDTA,2% SDS,pH7.0)緩沖液,混勻后在室溫下放置30 min,取4 mL,加入0.4 mL 0.1% DTNB(0.2 mol/L Tris-HCl,pH8.0);在40 ℃反應25 min后,測定412 nm處的吸光值,對照液用0.6 mol/L KCL-20 mmol/L Tris-馬來酸溶液代替樣品溶液外,其他試劑均一樣。計算公式如下:

式(2)

式中:X-總巰基摩爾濃度,mol/g；C0-肌原纖維蛋白質濃度,mg/mL;A-412 nm處的吸光值;D-稀釋倍數;ε-摩爾消光系數,13600 L/(mol·cm)。

1.2.2.10 活性巰基測定 取1 mL肌原纖維蛋白樣品溶液(0.4%),加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(10 mmol/L EDTA,2% SDS,pH7.0)緩沖液,混勻后在室溫下放置30 min,取4 mL,加入0.4 mL 0.1% DTNB(0.2 mol/L Tris-HCl,pH8.0);在40 ℃反應25 min后,測定412 nm處的吸光值,對照液用0.6 mol/L KCL-20 mmol/L Tris-馬來酸溶液代替樣品溶液外,其他試劑均一樣。計算公式如下:

式(3)

式中:X-活性巰基摩爾濃度,mol/g;C0-蛋白質濃度,mg/mL;A-412 nm處的吸光值;D-稀釋倍數;ε-摩爾消光系數,13600 L/(mol·cm)。

1.2.2.11 羰基化合物測定 羰基化合物含量測定參照 Estévez等[15]的方法并稍作修改。取0.5 mL肌原纖維蛋白溶液(0.4%)分裝于離心管中,其中一管加入2 mL 2,4-二硝基苯肼(DNPH)溶液(10 mmol/L,用2 mol/L HCl溶解),另一管加入2 mL 2 mol/L HCl溶液作為對照組。室溫條件下避光靜置1 h(每10 min渦漩混勻)。隨后加入2.5 mL 20%三氯乙酸沉淀蛋白,11000×g離心3 min,取沉淀用2 mL乙酸乙酯/乙醇(1∶1,v/v)洗滌3次,留沉淀。加入6 mL 6 mol·L-1的鹽酸胍溶解沉淀,室溫放置10 min后11000×g離心3 min,在370 nm波長下測定上清液的吸光度。蛋白質中的羰基含量(nmol/mg蛋白質)使用分子吸光系數22000 L·(mol·cm)-1計算。

式(4)

式中:X-羰基化合物摩爾濃度,mol/g;C0-肌原纖維蛋白質濃度,mg/mL;A-370 nm處的吸光值;D-稀釋倍數;ε-摩爾消光系數,22000 L/(mol·cm)。

1.2.2.12 Ca2+-ATPase酶活測定 采用南京建成生物工程研究所提供的超微量Ca2+-ATPase酶測試盒測定。

1.2.2.13 表面疏水性的測定 參考李清正等[16]方法,略作修改。以1-苯奈氨-8-磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonicacid,ANS)作為熒光探針,用pH7.0的0.6 mol/L KCl-10 mmol/L磷酸鹽緩沖液將肌原纖維蛋白質量濃度分別調至0.1、0.2、0.3、0.5 mg/mL。4種質量濃度的蛋白溶液各取4 mL,加入20 μL pH7.0含8 mmol/L ANS的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,混勻后用熒光分光光度計測定,條件為:激發波長和發射波長分別為390和470 nm,寬均為5 nm。用熒光強度對蛋白質濃度的斜率表示蛋白質表面疏水性。

1.2.2.14 內源熒光光譜 參考朱姝冉等[17]方法,略作修改。取3 mL肌原纖維蛋白溶液(1 mg/mL),置于1 cm四通石英比色皿中,以280 nm為激發波長,在熒光分光光度計上記錄270～450 nm波長范圍內的熒光發射光譜。發射光譜的操作條件為:掃面范圍270～450 nm,掃描速度2400 nm/min,激發狹縫和發射狹縫寬均為2.5 nm,響應時間為0.5 s,記錄數據波長間隔為1 nm。

1.3 數據處理

蛋白變性相關實驗每組至少三個平行,理化與感官實驗每組至少6個平行。所有試驗數據采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析,并用GraphPad Prism 5.0、OriginPro 2017 SR 2處理、作圖。

2 結果與分析

2.1 不同預處理對克氏原螯蝦揮發性鹽基氮(TVB-N)含量的影響

TVB-N值是評價水產品新鮮度的重要指標之一,也是評價水產品新鮮度最常用方法[18]?？耸显r在-18 ℃凍藏過程中,由于酶和微生物的作用,蛋白質被分解而產生氨類堿性含氮揮發性物質,其含量越高表明蛋白質被破壞程度越高。我國的水產品衛生標準TVB-N標準為20 mg/100 g。根據圖1分析,整個凍藏周期中克氏原螯蝦的TVB-N含量最高為17.14 mg/100 g,仍符合清水蝦的一級鮮度標準(20 mg/100 g)[19]。不同預處理下,隨著凍藏時間的推移,凍克氏原螯蝦的TVB-N含量有顯著差異(P<0.05)。熱燙組前8周的TVB-N含量變化不大,8周后開始顯著上升(P<0.05)?？赡茉蚴?克氏原螯蝦經熱燙預處理后能夠有效地殺死一定量微生物以及真空包裝形成缺氧環境抑制微生物生長,進而減緩蛋白質被破壞速率。而超高壓組與對照組TVB-N始終呈上升趨勢,且超高壓組TVB-N含量始終大于對照組。這一趨勢可看出UHP預處理促進蛋白質氧化,可能原因是高壓使蛋白質內部中的游離氨基酸暴露,且200 MPa的處理條件較弱,不能很好地殺死微生物。

圖1 不同預處理對克氏原螯蝦TVB-N含量的影響Fig.1 Effects of different pretreatment techniques on thecontent of volatile base nitrogen in Procambarus clarkii注:不同小寫字母代表蝦經同種預處理,不同貯藏時間存在顯著差異(P<0.05)；不同大寫字母代表同一時間內,不同預處理樣品間存在顯著差異(P<0.05),圖2～圖10同。

2.2 不同預處理對克氏原螯蝦硫代巴比妥酸(TBA)含量的影響

凍藏過程中克氏原螯蝦TBA值的變化情況見圖2。隨著貯藏時間的延長,克氏原螯蝦TBA值整體呈上升趨勢。預處理組在貯藏前8 周,TBA值變化趨勢基本一致,而對照組8周時顯著上升(P<0.05),貯藏12周超高壓組TBA值下降,可能原因是脂肪氧化產物丙二醛不穩定,與蝦肉中其他成分反應未被檢出,導致TBA值下降[20]。熱燙組貯藏前12周變化不明顯,24周時顯著性增大(P<0.05)。對照組前4周TBA值變化不大,8周時顯著上升(P<0.05)?？赡苡捎?18 ℃貯藏中脂肪氧化降解生成醛、醇等次級產物,使TBA值顯著上升(P<0.05),表明隨著凍藏時間的延長,樣品的氧化程度越高[21]。綜上所述,表明前12周UHP處理能有效地延緩脂肪氧化,熱燙效果次之。武華等[22]在研究鳙魚片在凍藏過程中TBA值隨貯存時間的延長先升高后下降;Abreu等[23]在研究大西洋比目魚凍藏過程脂質規律時也得出類似結論,可能原因是魚片的脂肪含量高于蝦。

圖2 不同預處理對克氏原螯蝦TBA含量的影響Fig.2 Effects of different pretreatment techniques on thecontent of thiobarbituric acid in Procambarus clarkii

2.3 不同預處理對克氏原螯蝦水分含量與pH的影響

pH作為檢測肉類新鮮度的重要指標,水分含量是影響克氏原螯蝦肉口感的重要因素之一[24]。由圖3可知,不同預處理的克氏原螯蝦的水分含量在整個-18 ℃凍藏過程中幾乎不改變。其中熱燙預處理組的克氏原螯蝦的水分含量從初始值80.44%下降到76.79%,大約流失水分3.65%,對照組與超高壓組凍藏的克氏原螯蝦的水分含量分別保持在78.23%和78.9%左右。李杰的研究表明,不同溫度下凍藏的南極磷蝦水分含量在前90 d變化不顯著(P>0.05),與本研究結果一致，其中熱燙處理流失了3.65%水分,可能原因是凍藏過程產生的干耗,隨著凍藏時間的延長,干耗問題也愈發顯著[19]。

圖3 不同預處理對克氏原螯蝦水分含量的影響Fig.3 Effect of different pretreatment techniqueson moisture content of Procambarus clarkii

從數值上可以看出,超高壓組在整個凍藏過程中克氏原螯蝦pH呈現前期先下降,中期上升,后期下降的三段式趨勢;而熱燙組呈先上升后下降的趨勢;對照組呈整體呈下降趨勢,中期下降不顯著。由圖4可知,在凍藏-18℃條件下,24周時對照組pH顯著性下降(P<0.05),超高壓組0周至4周下降,第8周顯著上升(P<0.05),8周后pH開始迅速減小。這可能是克氏原螯蝦真空包裝,使糖原的無氧酵解產生乳酸,以及ATP的分解產生磷酸根等,導致克氏原螯蝦肉的pH發生快速下降[25-26]。熱燙組0～4周緩慢上升,4周后開始緩慢下降。促使pH回升的原因可能與克氏原螯蝦體內的酶及微生物有關。隨著凍藏時間的推移,克氏原螯蝦體內的蛋白質在微生物與酶的共同作用下分解,分解產物大多數呈現堿性,故使得肌肉pH緩慢回升。這與李學英等[27]研究結果一致。熱燙組比超高壓組克氏原螯蝦pH高,這可能是蝦經高溫燙過后,蝦表面的微生物大部分被滅殺以及酶的部分滅活,其中殺菌效果高溫預處理優于本實驗條件下UHP。因此,貯藏過程中熱燙組pH穩定性較好[28]。

表1 不同預處理對克氏原螯蝦肉質構的變化Table 1 Changes in texture of Procambarus clarkii by different pretreatment techniques

圖4 不同預處理對克氏原螯蝦pH的影響Fig.4 Effect of different pretreatment techniqueson pH value of Procambarus clarkii

2.4 不同預處理對克氏原螯蝦肉質構的變化

TPA是模擬人的口腔,能夠通過數值來直觀地表述食品的各項感官指標[29]。表1為凍藏過程中克氏原螯蝦的質構分析結果。隨著凍藏時間的推移,克氏原螯蝦樣品硬度、黏性、咀嚼性等指標均呈現先上升后下降的趨勢。其中,彈性值呈現出下降的趨勢。硬度反映出樣品達到一定程度的形變所需要的力,在評價蝦的肉質時,硬度是一項重要指標[30]。咀嚼性表示食品的柔軟度,主要指將固態食品咀嚼到可以吞咽時所做的功[31],咀嚼性越高,相應的嚼勁就越好,咀嚼性在數值上等于硬度和凝聚性以及彈性的乘積[14]。因此,咀嚼性數值的減小是肌肉硬度降低、彈性減小和細胞間結合力下降綜合作用的結果。從表1可以看出熱燙組硬度值最大,相應的咀嚼值也最大,UHP次之,表明硬度與咀嚼性呈正相關(r=0.984)。除超高壓組的黏性呈前期下降,后期上升的趨勢以外,克氏原螯蝦肉的硬度、咀嚼性與黏性,隨著凍藏時間的延長,呈現前期上升,后期下降的趨勢。其中隨著凍藏時間的推移,下降速率:熱燙組>超高壓組>對照組。

表2 不同預處理對克氏原螯蝦色澤的變化Table 2 Changes in color of Procambarus clarkii by different pretreatment techniques

可能是熱燙預處理使克氏原螯蝦內的酶活性下降較快,蛋白質變性程度大,蝦肉相應質構指標下降隨之也快。而UHP可以較好地保護酶活性,故使克氏原螯蝦的硬度下降較緩慢。彈性指食品在外力作用下導致食品形變,卸掉外力后形變恢復的程度。隨著貯藏時間的推移,不同預處理條件下的克氏原螯蝦的彈性均呈下降趨勢。其中超高壓組的彈性下降最為緩慢,其次是熱燙組、對照組。蝦肉的彈性主要由肌原纖維蛋白決定,且UHP處理對肌原纖維蛋白有修飾作用[32]。熱燙預處理使蝦肉肌原纖維蛋白發生變性,巰基氧化為二硫鍵，導致蛋白質之間更加緊密,使蛋白質形成結構復雜的凝膠,因此對克氏原螯蝦肉彈性和粘著性有一定的提升效果,但溫度過高或加熱時間過長均會導致蛋白質凝膠出現劣化[33]。

2.5 不同預處理對克氏原螯蝦肉色澤的變化

蝦仁的色澤變化是表征蝦腐敗程度的重要參數。從表2中可以看出,對照組和預處理組樣品相比,樣品經UHP、熱燙預處理后,隨保藏期的延長,克氏原螯蝦蝦肉的顏色有明顯變化。結果表明,超高壓組與對照組,隨著保藏期的延長其L*值呈現出三段式變化,先上升,再下降,最后上升。而熱燙組的L*值變化不顯著(P>0.05),即熱燙預處理后,蝦的亮度值基本固定在72左右。L*值從0～100表示黑暗色到明亮色,說明UHP處理有助于提高蝦肉的亮度值,但提高效果不如熱燙組。這與甘曉玲[34]在UHP預處理南美白對蝦中發現的蝦仁表面及內部L*隨壓力的升高逐步增大的結果一致。a*值由大到小代表紅色到綠色。a*值在整個貯藏期中明顯下降;其中三組樣品在貯藏第4周時顯著性下降(P<0.05),直至貯藏三個月后下降速率開始緩慢。這可能原因是隨著貯藏期的推移,克氏原螯蝦中微生物開始繁殖,從而導致蝦肉從紅色轉變成綠色,而且不同預處理方式對細胞組織結構破壞程度不同,進而使蝦肉中蝦青素含量及其存在狀態發生變化[35]。這與李高尚等[36]研究結果一致。b*值由大到小表示黃色到藍色。貯藏末期,熱燙組蝦肉b*值最大,超高壓組與對照組差別不大。結果表明:熱燙處理對克氏原螯蝦的L*與a*有護色作用,超高壓組次之,對照組最差。

2.6 不同預處理對克氏原螯蝦肌原纖維蛋白的影響

克氏原螯蝦中的肌原纖維蛋白含量前期下降速率快,后期緩慢下降趨勢。如圖5所示,隨著凍藏時間的增加,克氏原螯蝦的肌原纖維蛋白溶出量呈現下降趨勢。-18 ℃凍藏下,對照組12周時肌原纖維蛋白含量為16.92 mg/mL,已下降到新鮮量的89.67%,第12～24周,肌原纖維蛋白含量從新鮮量的89.67%下降到75.30%。超高壓組第12周肌原纖維蛋白含量為15.34 mg/mL,已下降到新鮮量的62.03%,第12～24周,肌原纖維蛋白含量從新鮮量的62.03%下降到54.83%。超高壓組肌原纖維蛋白含量下降原因可能是肌原纖維蛋白球狀頭部結構在壓力的作用下,空間構象變化較顯著[37]。圖5可見,0周時超高壓組肌原纖維蛋白含量遠大于對照組,隨著凍藏時間的增加,第8周后，超高壓組蛋白含量顯著下降(P<0.05)且對照組肌原纖維蛋白值大于超高壓組。結果表明UHP預處理后的一定程度上促進肌原纖維蛋白溶出,但隨著凍藏時間的增加,超高壓組可很好的鎖住肌原纖維蛋白的溶出。任麗娜[13]通過研究發現白鰱魚肉的肌原纖維蛋白溶出量前期呈現快速下降,后期趨于平緩,這與本研究變化趨勢基本一致。由于熱燙預處理加熱克氏原螯蝦時間過長對蛋白質產生不可逆的負面影響,導致熱燙組的肌原纖維蛋白提取未成功,所以熱燙預處理的蛋白類指標均未測定,該實驗現象已被王振宇等[38]解釋。

圖5 不同預處理對克氏原螯蝦肌原纖維蛋白含量的影響Fig.5 Effects of different pretreatment techniqueson myofibrillar protein content in Procambarus clarkii

2.7 不同預處理對克氏原螯蝦巰基含量的影響

巰基的變化情況可以表征蛋白質的變性程度。如圖6所示,在-18 ℃貯藏下,經過同一預處理,隨著貯藏時間的延長,呈現出明顯差異。不同預處理,同一時間內(除0周、8周外),對照組、超高壓組有顯著性差異(P<0.05)?？値€基包含活性巰基和分子內部的巰基,整個儲藏過程中,活性巰基含量小于總巰基含量。-18 ℃凍藏下,對照組8 周時總巰基含量為3.65 μmol/g,已下降到新鮮的50.91%。超高壓組的小龍蝦第0周總巰基含量為7.67 μmol/g,經過4、8、24 周凍藏后,分別下降到新鮮量的46.54%、50.20%、47.33%?？赡茉蚴荱HP技術一定程度地改善了細胞膜通透性,巰基基團易暴露到分子表面,部分與空氣中的氧化劑充分反應,形成二硫鍵,從而導致蛋白分子的疏水性增加。郭麗萍等[39]在UHP結合熱預處理的豬肉蛋白過程中發現,凍藏過程中,UHP結合熱處理使豬肉蛋白中的巰基暴露，被空氣中氧氣氧化,加快二硫鍵的形成,導致總巰基含量下降,與本研究趨勢相似。

圖6 不同預處理對克氏原螯蝦巰基含量的影響Fig.6 Effects of different pretreatment techniques on thecontent of sulfhydryl groups in Procambarus clarkii

-18 ℃凍藏,對照組第12周活性巰基含量為3.6 μmol/g,已下降到新鮮量的72.29%,12～24周,活性巰基含量從新鮮量的72.29%下降到55.82%,前期快速下降,后期則變化比較緩慢。超高壓組0周時活性巰基含量為4 μmol/g,經過4、12、24周凍藏后,分別下降到新鮮量的81.25%、84.50%、44.00%。隨著凍藏時間的增加,肌原纖維蛋白樣品的活性巰基含量明顯降低,前期下降速率快、中期下降慢。這一現象原因可能是蛋白質的氧化變性形成蛋白質聚集體,會覆蓋一些巰基,使能夠檢測到的游離巰基數量減少,也導致巰基含量下降[40]。其中克氏原螯蝦的巰基含量均在前4周有較快的下降速率。研究發現巰基前期快速下降的可能原因是,蛋白質凍藏過程中,凍藏產生冰晶使蛋白質變性,使分子內活性巰基暴露,而活性巰基易于氧化成二硫鍵,造成總巰基含量的減少,進而導致活性巰基的減少[41]。

2.8 不同預處理對克氏原螯蝦羰基含量的影響

如圖7所示,貯藏4月后，羰基化合物含量顯著性上升(P<0.05)?？耸显r在凍藏過程中,羰基化合物是蛋白質氧化后較為顯著的一個變化,故將其作為表征蛋白氧化的重要指標之一。對照組克氏原螯蝦0周時羰基化合物含量為32.9 nmol/g,經4、12、24周凍藏后,分別上升到新鮮量的233%、572%、1296%。超高壓組羰基化合物貯藏12周含量為182.6 nmol/g,上升到新鮮的287%,12～24周時,羰基化合物含量從新鮮量的287%上升到702%,呈顯著性上升(P<0.05)。羰基化合物是自然氧化的主要產物,羰基化合物的顯著上升表明克氏原螯蝦在貯藏期間發生了明顯的蛋白氧化[42]。其中4～12周超高壓組的羰基值低于對照組。羰基物質主要是通過氨基酸的脫氨反應產生的,具體可通過多種途徑產生[43]。凍藏中期,蝦肉經UHP處理后,蛋白質的空間構象發生改變,肌原纖維蛋白發生折疊、聚集,游離氨基酸不易暴露蛋白表面,其表征為羰基化合物上升速率低于對照組?？赡茉騏HP能一定程度上延緩肌原纖維蛋白的氧化,這與巰基、Ca2+-ATPase酶活的趨勢相互印證。

圖7 不同預處理對克氏原螯蝦羰基含量的影響Fig.7 Effects of different pretreatment techniqueson the carbonyl content of Procambarus clarkii

2.9 不同預處理對克氏原螯蝦Ca2+-ATPase酶活含量的影響

肌原纖維蛋白是一類綜合類蛋白,主要包括原肌球蛋白、肌球蛋白、肌原蛋白、肌動球蛋白等幾類,其中影響Ca2+-ATPase酶活性的主要蛋白質是肌球蛋白,其活性與肌球蛋白的頭部區域密切相關,尤其是肌球蛋白頭部構象的變化及聚合,可作為判斷冷凍儲藏期間肌球蛋白頭部結構變化的較為靈敏的指標[44]。如圖8所示,克氏原螯蝦在-18 ℃貯藏下,超高壓組與對照組的Ca2+-ATPase酶活呈下降趨勢。對照組12周時Ca2+-ATPase酶活含量為0.47 μmol Pi/mg prot/10 min,已下降到新鮮的69.12%,第12～24周,Ca2+-ATPase酶活含量從新鮮量的69.12%下降到29.41%,Ca2+-ATPase酶活前期下降速率比較緩慢,后期變化較快。超高壓組的克氏原螯蝦第0周Ca2+-ATPase酶活含量為0.54 μmol Pi/mg prot/10 min,經過12、24周凍藏后分別下降到新鮮量的85.19%、37.04%。不同預處理,凍藏期前8周超高壓組Ca2+-ATPase酶活含量顯著低于對照組,但在凍藏12周后兩組之間差異不顯著(P>0.05)?？赡茉蚴荱HP處理后使克氏原螯蝦肌球蛋白非共價鍵被破壞,其頭部區域更加聚集,引起肌球蛋白構象的改變。Ca2+-ATPase酶活含量與肌原纖維蛋白溶出量,巰基變化呈現正相關。其中引起凍藏過程中小龍蝦肌原纖維蛋白質Ca2+-ATPase酶活性下降的原因有多種。閆春子等[37]認為巰基氧化形成二硫鍵導致的分子聚合是Ca2+-ATPase酶活性下降的主要原因。導致Ca2+-ATPase酶活性下降的原因可能是不同處理導致蛋白質之間的化學鍵發生變化,引起Ca2+-ATPase酶活的下降。

圖8 不同預處理對克氏原螯蝦Ca2+-ATPase酶活含量的影響Fig.8 Effects of different pretreatment techniqueson Ca2+-ATPase activity in Procambarus clarkii

2.10 不同預處理對克氏原螯蝦表面疏水性的影響

蛋白質表面疏水性可作為表征蛋白質分子內部疏水基團的暴露程度。如圖9所示,超高壓組與對照組的表面疏水性含量呈顯著性上升趨勢(P<0.05)。對照組克氏原螯蝦第0周表面疏水性值為26.36,經過4、12、24周凍藏后,分別為新鮮量的3.79、1.69、2.95倍。超高壓組的表面疏水性含量第8周含量為47.28,上升到新鮮的139%,經12、24周凍藏后,表面疏水性含量分別上升到新鮮量的255%、199%。由此可見,經過同一預處理,貯藏前期與末期表面疏水性值呈現出顯著性差異(P<0.05)。不同預處理,同一儲藏期內,對照組與超高壓組與有顯著性差異(P<0.05)。在貯藏4周時,表面疏水性值顯著性上升(P<0.05),之后驟降,隨之緩慢上升。4周時,表面疏水性值增加幅度大的原因,可能是由于凍藏引起蛋白質的化學鍵被破壞,肌原纖維蛋白質分子空間結構打開并逐漸伸展,從而破壞原有的結晶的形成,使埋藏在分子內部的巰基暴露出來,進而被氧化成二硫鍵,導致巰基含量減少[45-46]。這與2.7巰基的變化趨勢相對應。

圖9 不同預處理對克氏原螯蝦表面疏水性的影響Fig.9 Effects of different pretreatment techniqueson the surface hydrophobicity of Procambarus clarkii

2.11 不同預處理對克氏原螯蝦內源熒光光譜的影響

克氏原螯蝦的肉質鮮嫩,具有高蛋白、低脂肪、少量微量元素等優點,且蛋白中含有許多人體必需的氨基酸。組成蛋白質的氨基酸中,除含硫氨基酸外,僅有3種氨基酸在230～310 nm間有吸收,分別是色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe),其蛋白質中含有的芳香族氨基酸殘基側鏈基團具有吸收紫外入射光而發射熒光的特性,據該特點來研究變性過程中蛋白質的空間構象變化[47]。本實驗通過內源性熒光光譜峰的最大熒光強度值,推測出蛋白質的變性情況。

圖10 不同預處理對克氏原螯蝦內源熒光光譜的影響Fig.10 Effects of different pretreatment techniqueson endogenous fluorescence spectra of Procambarus clarkii

內源性熒光光譜是將激發波長設定為280 nm,觀察蛋白分子中色氨酸殘基的發射光譜,其最大發射波長λmax的變化反映了蛋白分子中色氨酸殘基所處的微環境及暴露程度。熒光最大吸收峰紅移表明色氨酸等熒光發射基團暴露于極性更大的微環境中,反之藍移則表明發射基團周圍的微環境極性減小,疏水性較大。UHP預處理克氏原螯蝦,280 nm處激發時,最大吸收波長見圖10,發射波長位移變化在342～337 nm。第0周時對照組樣品的肌原纖維蛋白內源性熒光的最大發射波長約為337.40 nm,超高壓組約為338 nm,隨著凍藏時間的推移,超高壓組的最大吸收峰發生先紅移后藍移的現象,超高壓組肌原纖維蛋白的內源性熒光掃描最大吸收峰對應的波長λmax在第4周時到達最大,隨后發生藍移現象。而對照組樣品的肌原纖維蛋白內源性熒光光譜的最大吸收峰在第8周達到最大,隨后發生藍移現象。隨著凍藏時間的延長,肌原纖維蛋白的內源性熒光掃描最大吸收峰均產生藍移現象,而超高組比對照組早4 周發生藍移現象,可能原因是UHP技術對肌原纖維蛋白變性有一定程度的促進作用以及對色氨酸微環境影響較大。內源性熒光強度逐漸下降的原因可能是-18 ℃凍藏使蝦肉中的水形成冰晶,進而破壞了肌原纖維蛋白天然的排列,蛋白展開變性使得原先位于內部的色氨酸殘基暴露于表面,活性基團的暴露引起分子間作用增強,蛋白質分子的再聚集導致更多色氨酸殘基被包裹于更加疏水的分子內部,從而引起肌原纖維蛋白的內源熒光強度下降[48]。

3 結論

之前研究表明,UHP技術作為當前一種熱門技術,具有冷殺菌的效果,且UHP預處理有助于蝦殼效率的增加[7]。課題組前期研究結果表明小龍蝦經熱燙處理后,雖然使蝦殼上的蝦青素一部分殘留到蝦肉上,但是蝦肉卻因高溫變性進而與蝦殼交聯,不利于蝦仁的完整性,不利于工業脫殼[49]。

對比不同預處理對貯藏克氏原螯蝦品質的影響,超高壓處理一定程度上對蛋白質的氧化起到促進作用,而熱燙處理延緩蛋白質氧化。綜合各個指標趨勢變化,TBA、TVB-N顯著上升(P<0.05)、pH整體呈下降的趨勢、a*值顯著下降(P<0.05)，相關品質的變化說明熱燙預處理有利于克氏原螯蝦貯藏。且熱燙預處理對蝦仁的色澤具有一定的保護作用,同時獲得較好的硬度、咀嚼性和彈性。

隨凍藏時間的推移,水分含量變化不顯著(P>0.05),肌原纖維蛋白、巰基、Ca2+-ATPase酶的顯著下降(P<0.05),羰基、表面疏水性顯著上升(P<0.05),肌原纖維蛋白內源熒光強度下降。與對照組相比,UHP預處理后蛋白氧化變性更嚴重,貯藏過程超高壓預處理會加速蛋白質氧化速度?？赡苁怯捎诒緦嶒灢捎玫腢HP條件所導致。此外,UHP預處理對蝦的色澤和質構等感官特性有適度的改善效果。

綜上所述,本研究為UHP與熱燙技術在水產品加工中的應用以及工業化生產克氏原螯蝦凍藏產品提供參考。