基于凋亡和自噬途徑的石榴皮多酚對人前列腺癌PC3細胞的抑制作用機制研究

馮甜 劉盟 程路峰 高曉黎 楊曉君

摘 要 目的：基于自噬和凋亡途徑研究石榴皮多酚（PPP）對人前列腺癌PC3細胞增殖的抑制作用機制。方法：采用CCK-8法考察不同質量濃度PPP（25～300 μg/mL）作用24、48、72 h對PC3細胞活性的影響，篩選給藥濃度和作用時間。將PC3細胞分為對照組（完全培養基）和PPP低、中、高質量濃度組，培養48 h后，采用流式細胞術和Annexin V-FITC/PI染色法分別檢測細胞周期分布和凋亡情況，采用Western blotting法檢測細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和自噬相關蛋白 LC3、Beclin-1、p62、Atg12、Atg16的表達水平。結果：選擇48 h為培養時間，PPP的半數抑制濃度為110 μg/mL，選擇50、100、200 μg/mL為低、中、高質量濃度。與對照組比較，PPP低、中質量濃度組G0/G1期細胞百分比均顯著降低而S期細胞百分比均顯著升高，PPP高質量濃度組G0/G1期細胞百分比顯著升高，PPP中、高質量濃度組G2/M期細胞百分比均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;PPP各質量濃度組細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與對照組比較，PPP各質量濃度組的抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬相關蛋白p62表達水平均有不同程度的下降，促凋亡蛋白Bax表達水平和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1、Atg5、Atg12和Atg16的表達水平均有不同程度的上升，且PPP高質量濃度組上述指標以及低、中質量濃度組上述部分指標組間比較差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論：PPP能抑制人前列腺癌PC3細胞增殖，其機制可能與誘導細胞發生自噬從而促進細胞凋亡有關。

關鍵詞 石榴皮多酚;前列腺癌;PC3細胞;凋亡;自噬;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the inhibitory mechanism of pomegranate peel polyphenols（PPP） on the proliferation of? human prostate cancer PC3 cells based on autophagy and apoptosis pathway.? METHODS： CCK-8 assay was used to investigate the effects of PPP with different concentrations（25-300 μg/mL） on PC3 cell activity after culturing for 24，48，72 h， so as to screen the drug concentration and treatment time. PC3 cells were divided into control group （complete culture medium）， PPP low-， medium- and high-concentration groups. After treated for 48 h， flow cytometry and Annexin V-FITC/PI staining were used to detect cell cycle distribution and apoptosis of PC3 cells. Western blotting assay was used to detect the expression of apoptosis-related protein as Bax， Bcl-2， as well as the expression of autophagy-related proteins as LC3，Beclin-1，p62，Atg12 and Atg16. RESULTS： The culturing time was chosen as 48 h. IC50 of PPP was 110 μg/mL， and 50， 100， 200 μg/mL were chosen as low， medium， high concentrations of PPP. Compared with control group， the percentage of PC3 cells at phase G0/G1 decreased significantly in PPP low- and medium-concentration groups while increased significantly at phase S; that of PC3 cells at phase G0/G1 increased significantly in PPP high-concentration group; while that of PC3 cells at phase G2/M decreased significantly in PPP medium- and high-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. The apoptosis rate of PC3 cells was increased significantly in PPP groups （P<0.05 or P<0.01）. Compared with control group， protein expression of anti-apoptosis protein Bcl-2 and autophagy-related promoting protein p62 were decreased in PPP groups to different extents， while protein expression of promoting-apoptosis protein Bax as wells as autophagy-related protein LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ration and protein expression of Beclin-1， Atg5， Atg12 and Atg16 were increased to different extents; there was statistical significance in above indexes in PPP high-concentration group and some of above indexes in PPP low- and medium-concentration groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： PPP can inhibit the proliferation of human prostate cancer PC3 cells， mechanism of which may be related to inducing autophagy and promoting apoptosis.

KEYWORDS? ?Pomegranate peel polyphenols;Prostate cancer;PC3 cell; Apoptosis; Autophagy; Mechanism

前列腺癌是中老年男性常見的惡性腫瘤，其在我國的發病率也逐漸上升，至今還是臨床難以攻克的疑難之癥[1-2]，因此探索更加高效便捷的治療方法具有重要意義。有研究表明，前列腺癌的發展與自噬有密切關系[3]。自噬是細胞吞噬自身細胞質蛋白或細胞器進入囊泡，與溶酶體形成自噬溶酶體并降解其包裹的內容物的過程，以此可更新細胞器并完成細胞的自身代謝[4]。適度自噬能讓靶細胞對外界損傷作出反應，使其存活，同時也能夠將受損的細胞器清除干凈，有利于維持細胞穩態[5]。在前列腺癌的治療過程中，化療藥物能夠激活腫瘤細胞自噬，進而誘導細胞凋亡[6];自噬也能通過對受損細胞器的降解和再利用來保護細胞器和細胞成分免受損傷[7]，因此自噬作用可能具有重要的臨床價值。

研究表明，石榴科石榴屬植物石榴（Punica granatum L.）的果汁和果皮提取物均能抑制人前列腺癌PC3細胞系的增殖、遷移和集落形成，且果皮提取物比果汁的效果更優[8]。為了探討石榴果皮有效部位的抗腫瘤活性，本課題組開展了前期研究工作，結果發現石榴皮多酚（Pomegranate peel polyphenols，PPP）對PC3細胞具有一定的抑制作用，并可促進其凋亡，表現出一定的抗腫瘤活性[9-11]?；诖?，本文將基于自噬與凋亡途徑研究PPP對人前列腺癌PC3細胞的抑制作用機制，為闡明PPP治療前列腺癌的藥效機制奠定理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

HERAcell 150i型CO2恒溫培養箱、KS12型生物安全柜、iBright FL1000型凝膠制備成像系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）;ME54E型分析天平（上海升亮電子科技有限公司）;4K1S型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）;SpectraMax M5型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）;LSR Ⅱ型流式細胞儀（美國BD公司）;Mini-Protean 1658001型電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

PPP[新疆醫科大學藥學院自制，批號：20171224，含量：82.7%（采用高效液相色譜法測定，以安石榴苷計）[12]]由新疆醫科大學藥劑教研室常占瑛實驗師提供。

RPMI 1640培養基、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、胰蛋白酶（美國Hyclone公司，批號：SH30809.01、SH30256.01B、J170041）;胎牛血清（FBS）、青-鏈霉素雙抗（美國Gibco公司，批號：10099141、15140-122）;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（日本Dojindo公司，批號：KR675）;Annexin V/PI試劑盒（上海貝博生物科技公司，批號：BB-4101）;山羊抗兔Bax單克隆抗體、山羊抗兔Bcl-2單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：50599-2、12789-1）;山羊抗兔單克隆自噬抗體檢測試劑盒（包含多種自噬相關蛋白的一抗及二抗）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗、內參GAPDH（美國CST公司，批號：4445T、7074P2、2118S）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：26616）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：23227）;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 細胞

人前列腺癌PC3細胞株由上海賽百慷生物技術股份有限公司提供（液氮中保存）。

2 方法

2.1 細胞培養和溶液配制

取LC3細胞進行復蘇，加入完全培養基（即含有10%FBS+1%青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基），混勻后接種于培養瓶中，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養（以下培養條件相同），6 h后觀察細胞鋪板狀態，次日換液。取處于對數生長期的細胞用于后續試驗。

取PPP粉末，加水制成質量濃度為800 μg/mL的PPP母液;臨用時，取該母液用完全培養基稀釋，制成相應質量濃度的PPP藥液（現用現配），用于后續試驗。

2.2 PPP對PC3細胞增殖活性的影響考察

采用CCK-8法對細胞增殖活性進行檢測。取對數生長期的PC3細胞，計數后，用完全培養基重懸制成5 000個/mL的細胞懸液，按每孔100 μL接種于96孔板中。將細胞分為對照組和不同質量濃度的PPP干預組，培養至細胞貼壁后，棄去培養液，對照組加入完全培養基，PPP干預組加入相應質量濃度的PPP藥液（PPP終質量濃度分別為25、50、100、150、200、250、300 μg/mL[12]）。每組設置6個復孔進行重復試驗。各組細胞分別培養24、48、72 h后，分別加入CCK-8檢測試液10 μL，繼續培養2 h后，采用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔吸光度（OD），OD值越高，即表明細胞活性越高。計算PC3細胞的增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（對照組平均OD值-PPP干預組平均OD值）/對照組平均OD值×100%，并據此計算PPP對PC3細胞的半數抑制濃度（IC50）。

2.3 PPP對PC3細胞周期的影響考察

采用流式細胞術對細胞周期分布進行檢測。取對數生長期PC3細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，以完全培養基制成8 000個/mL的細胞懸液，按每孔2 mL接種于6孔板中。將細胞分為對照組和PPP低、中、高質量濃度組，培養至細胞貼壁后，棄去培養液，對照組加入完全培養基，藥物組加入低、中、高質量濃度的PPP藥液（質量濃度參考“2.2”項下IC50值結果的0.5、1.0、2.0倍設置），繼續培養48 h。培養完畢后，棄去培養液，用PBS洗2～3次，每次3 mL;以0.25%胰蛋白酶消化細胞后，加入完全培養基3 mL，以1 000 r/min離心5 min;吸棄上清液，再用PBS 1 mL重懸細胞，以1 000 r/min離心5 min;吸棄上清，加入無水乙醇固定過夜;次日加入PI染料，在室溫下避光染色30 min，并于2 h內采用流式細胞儀測定細胞周期并計算各時相的細胞百分比。試驗重復3次。

2.4 PPP對PC3細胞凋亡的影響考察

采用流式細胞術對細胞凋亡情況進行檢測。取對數生長期PC3細胞，按“2.3”項下方法消化、接種、分組、給藥并培養48 h后再消化、離心。收集細胞，加入Binding Buffer 100 μL、Annexin V-FITC試劑5 μL和PI 試劑10 μL，混勻，在室溫下避光靜置15 min;再加入Binding Buffer 400 μL，用200目篩網濾過。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況并計算細胞凋亡率：細胞凋亡率（%）=細胞凋亡數/細胞總數×100%。試驗重復3次。

2.5 PPP對PC3細胞凋亡和自噬相關蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法對凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和自噬相關蛋白 LC3、Beclin-1、p62、Atg-12、Atg-16的表達水平進行檢測。取對數生長期PC3細胞，按照“2.3”項下方法消化、接種、分組、給藥并培養48 h后再消化、離心。收集細胞，加入RIPA裂解液100 μL+苯甲基磺酰氟（PMSF）1 μL的混合液進行裂解后，吹打細胞，在冰上放置2～3 h后，以12 000 r/min離心15 min。取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度后，煮沸蛋白使其變性。取變性后的蛋白適量，進行SDS-PAGE，隨后轉膜1.5 h，再封閉2 h，用TBST緩沖液洗滌之后分別加入Bax、Bcl-2、LC3、Beclin-1、p62、Atg12、Atg-16和GAPDH的一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;次日以TBST緩沖液洗滌后，加入相應二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），37 ℃下避光孵育2 h，然后加入ECL超靈敏發光液曝光。采用凝膠制備成像系統進行檢測，以Image Lab 3.0軟件對目標條帶進行分析。以GAPDH為內參，按目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比表示目的蛋白的表達水平。試驗重復3次。

2.6 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 PPP對PC3細胞增殖活性的影響

與對照組比較，隨著PPP質量濃度的升高，細胞的增殖抑制率也逐漸升高;當以200 μg/mL及以上的PPP培養48 h時，細胞增殖抑制率不再明顯升高;當以150～300 μg/mL的PPP分別培養24 h及以50～300 μg/mL的PPP分別培養48、72 h時，細胞增殖抑制率均顯著低于對照組（P<0.05或P<0.01），且PPP作用48、72 h時的細胞增殖抑制率較為接近。因此，后續試驗選擇48 h為培養時間。此外，根據SPSS 21.0軟件計算出PPP對PC3細胞的IC50值為110 μg/mL，并據此將后續試驗中PPP低、中、高質量濃度分別設定為50、100、200 μg/mL（分別接近于0.5、1.0、2.0倍IC50）。PPP對PC3細胞的增殖抑制率見圖1。

3.2 PPP對PC3細胞周期分布的影響

與對照組比較，PPP低、中質量濃度組G0/G1期細胞百分比均顯著降低，S期細胞百分比均顯著升高（P<0.01或P<0.05）;PPP高質量濃度組G0/G1期細胞百分比顯著升高（P<0.05）;PPP中、高質量濃度組G2/M期細胞百分比均顯著降低（P<0.01）。PPP作用下PC3細胞周期的分布圖見圖2，不同時相細胞百分比見表1。

3.3 PPP對PC3細胞凋亡的影響

與對照組比較，PPP低、中、高質量濃度組細胞凋亡率均顯著升高（P<0.01或P<0.05）。PPP作用下PC3細胞凋亡的散點圖見圖3，細胞凋亡率見表1。

3.4 PPP對PC3細胞凋亡及自噬相關蛋白表達的影響

3.4.1 凋亡相關蛋白 與對照組比較，PPP各質量濃度組細胞中Bax蛋白表達水平均呈升高趨勢，其中PPP高質量濃度組Bax蛋白表達水平較對照組顯著升高（P<0.05）;PPP各質量濃度組細胞中Bcl-2蛋白表達水平均呈下降趨勢，其中PPP中、高質量濃度組Bcl-2蛋白表達水平均較對照組顯著降低（P<0.05）。PPP作用下PC3細胞中凋亡相關蛋白表達的電泳圖見圖4，蛋白表達水平檢測結果見表2。

3.4.2 自噬相關蛋白 與對照組比較，PPP各質量濃度組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1、Atg12、Atg16蛋白表達水平總體呈升高趨勢，其中PPP高質量濃度組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Atg12、Atg16蛋白表達水平以及PPP中、高質量濃度組Beclin-1蛋白表達水平均較對照組顯著升高（P<0.05）;PPP各質量濃度組細胞中p62蛋白表達水平均較對照組顯著降低（P<0.05）。PPP作用下PC3細胞中自噬相關蛋白表達的電泳圖見圖5，蛋白表達水平見表3。

4 討論

研究發現，PPP具有抑制腫瘤細胞增殖及促進其凋亡的作用[13]。細胞增殖抑制是藥物抑制作用的綜合性表現之一，其機制可能與細胞凋亡、周期阻滯、壞死及衰老等原因有關。有研究表明，干預及調節腫瘤細胞的周期進而阻滯其生長是目前腫瘤治療的重要方法[14]。但目前并未見從分子機制方面報道PPP對人前列腺癌PC3細胞的促凋亡作用。因此，本研究采用CCK-8法檢測了不同質量濃度PPP對PC3細胞增殖活性的影響，結果顯示PPP能抑制PC3細胞增殖;當PPP質量濃度為200～300 μg/mL、作用時間為48～72 h時，細胞增殖抑制率基本到達平臺期，且IC50為110 μg/mL，因此以50、100、200 μg/mL的PPP作用48 h進行后續試驗。細胞凋亡和周期阻滯試驗的結果顯示，PPP能有效阻滯PC3細胞由G0/G1期向S期轉化，阻止細胞生長，并誘導其凋亡。

現有研究表明，細胞凋亡與自噬活性的調控有關，自噬水平的下調可以促進前列腺癌細胞的生長，通過藥物等干預方式上調自噬水平后，能誘導細胞凋亡[15-17]。在此基礎上，本研究將PPP作用于PC3細胞，并通過檢測細胞自噬水平來探索自噬活性對PPP誘導PC3細胞凋亡的影響，為闡明PPP抑制腫瘤細胞增殖的機制提供依據。Bax和Bcl-2是細胞凋亡相關的重要標志性蛋白，其中促凋亡蛋白Bax接收到誘導凋亡信號后，能激活Caspase家族從而導致細胞凋亡;而抗凋亡蛋白Bcl-2能影響線粒體膜的通透性，從而抑制Caspases的激活，進而抑制細胞凋亡[16]。本研究結果顯示，與對照組比較，隨著PPP質量濃度的升高，PC3細胞中Bax的表達水平有不同程度的升高，Bcl-2的表達水平有不同程度的降低，表明PPP可誘導前列腺癌細胞的凋亡。

自噬本身作用機制及其在腫瘤中的作用非常復雜[18]，作為誘導細胞發生自噬的標志性蛋白，LC3、Beclin-1是反映細胞自噬水平的重要標志[19]。其中，LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，LC3-Ⅰ在磷脂酰乙醇胺的酯化作用下轉化為LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例的升高是自噬水平上升的標志[20]。另一自噬標志蛋白p62是細胞自噬的降解底物，當自噬作用增強時，p62的降解增加，細胞中的p62蛋白表達水平隨之下降[21]。在本研究中發現，與對照組相比，自噬主要標志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表達水平在PPP各質量濃度組細胞中均有不同程度的升高，表明細胞自噬水平升高;p62表達水平則顯著降低，說明p62被降解，從而誘導細胞發生凋亡。這一結果與宋峰等[19]的研究一致。除此之外，自噬體的形成還有賴于自噬相關基因（ATG）相關蛋白的共價結合[21]。本研究結果顯示，與對照組比較，自噬相關蛋白Atg12和Atg16表達水平明顯提高，說明在藥物干預過程中PC3細胞形成了自噬體[21]。這進一步表明了PPP可能是通過誘導自噬進而促進凋亡這一機制而對PC3細胞增殖產生了抑制作用。

綜上所述，PPP能抑制人前列腺癌PC3細胞增殖，其機制可能與誘導細胞發生自噬從而促進細胞凋亡有關。然而，PPP誘導自噬從而抑制腫瘤發展的相關機制尚不完全清楚，還需進一步深入研究。

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（收稿日期：2020-02-25 修回日期：2020-07-07）

（編輯：段思怡）