GPRC5A促進人骨肉瘤細胞系143B遷移和侵襲

宋 奇，程安源，余 鈴，徐 立*

(武漢市第一醫院 骨科， 湖北 武漢 430022； 2.武漢大學人民醫院 骨科， 湖北 武漢 430060)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是一種好發于兒童和青少年長管狀骨干骺端的惡性腫瘤，早期容易出現遠處轉移，肺臟是最常見的轉移部位。由于缺乏早期診斷手段，據估計，有15%～20%的骨肉瘤患者在確診時已經出現遠處轉移。對于局限性骨肉瘤患者，經過規范診療后，患者5年生存率可達65%～70%，而對于發生轉移的骨肉瘤患者，缺乏有效的治療手段，患者預后較差，5年生存率僅20%左右[1-2]。因此，尋找骨肉瘤早期轉移的分子標記、探究骨肉瘤早期轉移的分子機制、尋找新的藥物作用靶點，對于骨肉瘤患者的早期診斷和個體化治療具有重要意義。

本研究利用GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫中數據集GSE32981及TCGA數據庫(The Cancer Genome Atlas)中骨肉瘤患者的臨床數據，利用生物信息學手段進行聯合分析，篩選出感興趣基因，并通過后續的實驗進行驗證，以期為闡明骨肉瘤轉移的分子機制及相關藥物的開發提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤143B細胞系(中國科學院上海細胞庫)；α-MEM培養基和胎牛血清(Gibco公司)；1%雙抗(青霉素100U/mL, 鏈霉素100μg/mL)、胰蛋白酶(武漢谷歌生物科技公司)；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)(上海碧云天生物科技有限公司)；抗E-Cad、N-Cad、Vim和GAPDH一抗(CST公司)；抗GPRC5A一抗(SCBT公司)；PC3.1-EGFP-Flag和PC3.1-GPRC5A-Flag過表達載體及GPRC5A特異性siRNA序列(siGPRC5A)及對照組序列(siNeg)(武漢生工生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析：使用R軟件對原始數據集GSE32981進行差異基因的篩選和數據的可視化，設置篩選條件為：|log2(Fold Change)|>1且P<0.05，結合TCGA數據庫中骨肉瘤轉錄組數據以及患者臨床特征對差異基因進行生存分析。數據集GSE126209用來分析骨肉瘤腫瘤組織和相應正常組織中GPRC5A表達水平。

1.2.2 細胞的培養及轉染：用含有10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養基培養人骨肉瘤143B細胞，隔天換液，取對數期細胞進行實驗。細胞轉染時，將143B細胞接種在6孔板中，待細胞匯合度為60%～70%后，棄掉培養基，PBS洗滌2次后，加入1 mL培養基，根據轉染試劑說明書，將質粒(PC3.1-EGFP-Flag或PC3.1-GPRC5A-Flag)或者siRNA(siNeg或siGRPC5A)轉染至HepG2細胞中，共包括4組：siNeg組、siGPRC5A組、EGFP組和GPRC5A組。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖：將轉染48 h后的143B細胞重懸，調整細胞濃度為5×104個/mL，取100 μL接種在96孔板中，待接種8、24、48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養箱中避光孵育1 h后，用全自動多功能酶標儀檢測每孔細胞在450 nm波長下的吸光度值(A)。

1.2.4 劃痕實驗：將143B細胞接種在6孔板中，待細胞匯合度達60%～70%后，轉染GRPC5A過表達質粒和特異性siRNA及各自對照組，轉染后8 h換液，待6孔板底細胞匯合度達100%，在各組細胞6孔板底劃出“十”字線，用無血清的α-MEM培養基繼續培養24 h后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合度，拍照記錄。

1.2.5 Transwell小室法侵襲實驗：用α-MEM不完全培養基重懸轉染48 h后的143B細胞，調整細胞濃度為5×105個/mL，在Transwell小室上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加入500 μL完全培養基。繼續培養48 h后，用PBS清洗Transwell小室，4%多聚甲醛室溫固定30 min后，用結晶紫染液染色20 min，使用倒置顯微鏡拍照，計數，每組重復3次。

1.2.6 RT-qPCR檢測GPRC5A和EMT相關基因的表達：收集各組細胞，Trizol法提取總RNA，取1 μg總RNA反轉錄成為cDNA后，進行實時熒光定量PCR檢測，條件設置為：預變性94 ℃, 2 min；變性94 ℃ 30 s, 退火60 ℃ 30 s, 延伸 72 ℃ 30 s，共計45個循環，采用2-ΔΔCt法計算各基因表達水平。RT-qPCR引物(表1)。

表1 RT-qPCR實驗的引物序列Table 1 Primer Sequence of RT-qPCR

1.2.7 Western blot檢測GPRC5A和EMT相關蛋白的表達：收集各組細胞，提取總蛋白，用BCA法蛋白定量后取10 μg總蛋白，進行10%或12% SDA-PAGE蛋白膠電泳分離，轉膜后室溫封閉1 h，TBST洗滌3次將條帶置入相應的一抗中孵育過夜。TBST溶液振搖洗滌3次，將條帶置于辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000稀釋)中室溫搖床孵育1 h。用TBST洗滌3次后，將條帶置于ECL試劑盒A液和B液混合液(1∶1混合)中，然后進行曝光分析。蛋白表達水平=目的蛋白吸光度值/GAPDH的吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 骨肉瘤轉移瘤生物信息學分析

數據集GSE32981含有23個人骨肉瘤組織樣本，其中原發瘤12個，轉移瘤11個。與原發瘤相比，轉移瘤中有299個基因表達水平發生改變(圖1A，B)。

A.volcano map of differentially expressed genes in GSE32981 data set; B.heatmap of differentially expressed genes in GSE32981 data set圖1 骨肉瘤原位瘤和轉移瘤差異基因分析Fig 1 Differential expression genes analysis in primary and metastatic osteosarcoma

2.2 差異基因生存分析

分析TCGA數據庫中骨肉瘤患者的臨床信息，發現有2 310個基因的表達水平與骨肉瘤患者生存相關(P<0.05)，有37個基因在骨肉瘤轉移瘤中差異表達(圖2A)。其中，GPRC5A在轉移瘤中上調明顯(P<0.01)(圖2B)并且高表達與骨肉瘤患者生存差相關(P<0.05)(圖2C)。此外，與正常組織相比，骨肉瘤組織中GPRC5A表達明顯增高(P<0.01)(圖2D)。

A.Venn diagram of differentially expressed genes in GSE32981 data set and genes related to survival in TCGA data set; B.heatmap of the 37 genes in primary and metastasis osteosarcoma; C.survival analysis of osteosarcoma patients with different expression level of GPRC5A; D.the expression of GPRC5A in osteosarcoma sample and adjacent normal圖2 骨肉瘤轉移瘤差異基因生存分析Fig 2 Survival analysis of differential expression genes in primary and metastatic n=3)

2.3 骨肉瘤143B細胞中GPRC5A敲低或過表達效率驗證

siGPRC5A組細胞中GPRC5A的mRNA和蛋白表達水平低于siNeg組(P<0.01,P<0.05)(圖3A～C)；GPRC5A組細胞中GPRC5A的mRNA和蛋白表達水平顯著高于EGFP組(P<0.01)(圖3D～F)。

A.after transfection with siGPRC5A, the expression of GPRC5A were detected by RT-qPCR; B.Western blot; C.quantitative analysis of Western blot; D.after transfection with GPRC5A over-expression plasmid, the expression of GPRC5A were detected by RT-qPCR; E: Western blot; F: quantitative analysis of Western blot; *P<0.05，**P<0.01 compared with siNeg or EGFP圖3 RT-qPCR和Western blot檢測各組細胞中GPRC5A表達水平Fig 3 RT-qPCR and Western blot detected the expression levels of GPRC5A in different n=3)

2.4 GPRC5A對骨肉瘤細胞增殖的影響

與siNeg組相比，siGPRC5A組細胞增殖能力無顯著改變(圖4A)。與EGFP組相比，GPRC5A組細胞增殖能力無顯著改變(圖4B)。

2.5 GPRC5A對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響

GPRC5A組24 h后劃痕愈合明顯，而siGPRC5A組24 h后未見明顯愈合(圖5A，B)。GPRC5A組24 h后侵襲穿過Transwell小室和基質膠的細胞數目明顯增多，而siGPRC5A組24 h后穿過Transwell小室和基質膠的細胞數目顯著減少(圖5C)。

2.6 GPRC5A對骨肉瘤細胞EMT相關基因表達的影響

敲低143B細胞中GPRC5A的水平，可引起E-Cad的mRNA和蛋白水平顯著升高, Vim的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖6A～C)，而GPRC5A過表達143B細胞中E-Cad的mRNA和蛋白水平顯著降低，N-Cad和Vim的mRNA和蛋白水平顯著升高(圖6D～F)。

A.after transfection with siGPRC5A, the expression of EMT associated genes were detected by RT-qPCR; B.Western blot; C.quantitative analysis of Western blot; D.after transfection with GPRC5A over-expression plasmid, the expression of EMT associated genes was detected by RT-qPCR; E.Western blot; F.quantitative analysis of Western blot; *P<0.05，**P<0.01 compared with siNeg or EGFP group圖6 GPRC5A對骨肉瘤細胞EMT相關基因mRNA和蛋白表達的影響Fig 6 Effect of GPRC5A on the mRNA and protein levels EMT associated markers of osteosarcoma n=3)

3 討論

GPRC5A(G protein-coupled receptor family C, member 5, group A)是G蛋白偶聯受體C型家族5A基因的簡稱，位于人12號染色體上，其編碼的蛋白質含有7個跨膜結構域，廣泛參與細胞內信號傳導，并參與調控細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，與腫瘤的發生、發展、轉移密切相關[3-4]。目前關于GPRC5A與腫瘤的研究集中在肺癌、胃癌和乳腺癌中， 研究表明[5]，GPRC5A是肺癌特異的抑癌基因，但在胃癌和乳腺癌中，高表達的GPRC5A能起到癌基因的作用，而GPRC5A在骨肉瘤中的作用目前還未見報道。

本研究通過分析公共數據庫發現GPRC5A在骨肉瘤轉移瘤中高表達并與患者的生存密切相關，并且在腫瘤組織中的表達也高于相應的正常組織，提示GPRC5A在骨肉瘤的發生和轉移中可能發揮重要作用。為進一步探究GPRC5A在骨肉瘤中的作用，本研究檢測GPRC5A敲低或過表達對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響，結果表明，GPRC5A不影響骨肉瘤細胞增殖，GPRC5A過表達的骨肉瘤細胞遷移和侵襲能力顯著提高，敲低骨肉瘤細胞中GPRC5A表達水平能顯著抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，這些結果表明GPRC5A能促進骨肉瘤的轉移。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenehymal transition, EMT)是具有黏附性的上皮細胞失去極性，向無極性的具有高度遷移和侵襲能力的間質細胞轉化的過程[6]，伴隨著上皮表型蛋白如E-cad的減少，間充質表型蛋白如N-cad, Vim的增多[7]。本研究表明，GPRC5A過表達能引起間充質表型蛋白N-Cad和Vim的水平顯著升高，敲低骨肉瘤細胞中GPRC5A可引起上皮表型蛋白E-Cad顯著升高，說明GPRC5A過表達可能是通過促進骨肉瘤細胞發生EMT進而促進其遷移和侵襲。不過，本研究僅從細胞水平探究GPRC5A對骨肉瘤細胞遷移和侵襲的影響，而骨肉瘤的轉移是一個在體發生的多階段、多因素參與的復雜過程[8]，因此，在動物水平上驗證GPRC5A對骨肉瘤轉移的影響有待后續進一步研究。

綜上所述，本研究表明，GPRC5A能通過誘導EMT促進骨肉瘤細胞遷移和侵襲，并與骨肉瘤患者生存密切相關，可作為抗骨肉瘤轉移藥物潛在作用靶點。