乙型肝炎病毒X蛋白抑制肝癌細胞系中DKK2的表達

王曉艷，杜 虹，王 偉，權會琴

(空軍軍醫大學唐都醫院 傳染科， 陜西 西安 710038)

原發性肝癌目前位于全球腫瘤相關死亡原因的第4位。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發性肝癌的90%，主要歸因于慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、酗酒和代謝綜合征[1-2]。其中，HBV引起的慢性乙型肝炎是肝癌發生的最常見病因。乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein, HBx)是一種多功能調節因子，可促進肝細胞的致癌轉化[3]。雖然HBx在HCC致病中的作用已有廣泛研究，但HBx調控HCC進展的分子機制仍未完全闡明。

Wnt/β-catenin信號通路廣泛參與到胚胎發育、穩態維持和腫瘤發生等多種過程，包括肝癌在內的多種癌中均已觀察到Wnt/β-catenin信號通路的異?；罨痆4]。研究提示DKK2基因及其表觀遺傳沉默在Wnt/β-catenin信號通路的活化和HCC中發揮關鍵作用，但HBx是否通過表觀遺傳調控影響DKK2的表達尚不明確。本研究主要探討肝癌細胞系中HBV X蛋白對DKK2表達的影響及其機制，為闡明HBV相關HCC的發生機制及干預治療靶點的探索提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞系SMMC7721和HepG2均為本實驗室保存。Ad-HBx由重慶醫科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室提供，構建方法見參考文獻[5]。GFP腺病毒(Ad-GFP)由漢恒生物公司合成；siDnmt1腺病毒(Ad-siDnmt1)由上海生工生物公司制備；小干擾RNA siDnmt3a(西安擎科澤西生物科技有限公司)；PCR引物由上海生工生物公司合成；反轉錄試劑盒使用羅氏Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit；DKK2抗體(Abcam公司)；Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b抗體(CST公司)；羊抗兔HRP(西安壯志生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組處理：將SMMC7721細胞和HepG2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養，培養條件為37 ℃ 5% CO2，隨后以1×105個/mL的濃度鋪于6孔板的細胞培養皿中，貼壁后加入 Ad-GFP(MOI=10)和Ad-HBx(MOI=30)進行感染，24 h后在顯微鏡下觀察其熒光強度，48 h后棄去培養基并收集細胞，用于后續實驗。同時用1 μmol/L DAC處理細胞，或用Ad-siDnmt1(MOI=10)感染細胞，利用X-TremeGENE siRNA試劑轉染小干擾RNA siDnmt3a，48 h后收樣。

1.2.2 實時定量PCR檢測HBx基因RNA：利用1 mL Trizol試劑裂解細胞，每管中加入200 μL三氯甲烷，4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，吸上清于新的Ep管中；每管中加入等量的異丙醇，-20 ℃沉淀過夜；4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，棄上清；每管中加入1 mL的75%無水乙醇，4 ℃ 12 000 r/min離心1 h，棄上清；晾干后加入20 μL的DEPC水溶解RNA；用ScanDrop定量儀測定RNA濃度。隨后利用羅氏反轉錄試劑盒將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，按照說明書中各組份的使用量在冰上配制20 μL RT反應混合液，反應條件為：50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。靶基因的mRNA水平使用MIX試劑在羅氏Cobas 480上進行檢測。GAPDH作為內部參照，最后使用2-△△Ct法計算各基因相對表達量。

1.2.3 Western blot檢測DKK2及甲基化轉移酶蛋白：采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。隨后用12% SDS-PAGE膠分離蛋白，每孔上樣量20 μg；250 mA恒流將蛋白轉到PVDF膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；一抗(1∶800)孵育4 ℃過夜；TBST清洗PVDF膜3次；加入羊抗兔HRP二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h；TBST洗滌后，加入底物發光劑 ECL 1 mL，在暗室用單層透明薄膜包裹后曝光膠片；拍照，利用Image J軟件進行蛋白定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Ad-HBx在肝癌細胞中感染效率

Ad-HBx感染肝癌細胞后，其中HepG2細胞感染效率達95%以上，SMMC7721細胞感染效率達90%以上。RT-qPCR檢測發現，Ad-HBx感染肝癌細胞24 h后，與對照組相比，在HepG2和SMMC7721細胞中，HBx mRNA相對表達倍數分別上調61.12倍和50.24倍(P<0.05)(圖1)。

A.efficiency of infection as detected by GFP expression using fluorescence microscopy in HepG2 and SMMC7721; B.the mRNA expression levels of HBx was detected by quantitative real-time PCR; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖1 Ad-HBx在肝癌細胞中的感染效率Fig 1 Infective efficiency of Ad-HBx in hepatocellular

2.2 HBx下調DKK2的表達

Western blot結果顯示，與Ad-GFP感染組相比，在HepG2和SMMC7721細胞中，Ad-HBx感染組中DKK2的表達均下降。通過軟件量化分析條帶發現，HepG2和SMMC7721細胞Ad-HBx感染組中DKK2蛋白表達分別下調1.61倍(P<0.05)和3.33倍(P<0.05)(圖2)。

A.DKK2 expression at protein level was tested by Western blot; B.protein bands and quantitative analysis of DKK2 expression; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖2 HepG2和SMMC7721細胞中HBx對DKK2的表達影響Fig 2 Effect of HBx on DKK2 expression in HepG2

2.3 HBx上調甲基化轉移酶Dnmt1和Dnmt3a的表達

相較于Ad-GFP感染組，Ad-HBx感染細胞系后，DKK2的蛋白表達水平下調2.65倍(P<0.05)，Dnmt1上調3.15倍(P<0.05)；Dnmt3a上調1.96倍(P<0.05)，相較于Ad-HBx感染組，DAC處理后DKK2蛋白表達水平上調2.27倍(P<0.05)；Dnmt1下調1.34倍， Dnmt3a下調1.78倍(P<0.05)(圖3)。

A.after 1 μmol/L DAC treatment, the expression of DKK2,Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b protein level was detected by Western blot; B.protein bands and quantitative analysis of DKK2,Dnmt1,Dnmt3a and Dnmt3b expression; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖3 SMMC7721細胞中HBx對DKK2、Dnmts的表達影響及DAC處理細胞后各蛋白的變化情況Fig 3 Influence of HBx on the expression of DKK2 and Dnmts and the changes of each protein after DAC treatment

2.4 沉默Dnmts后DKK2的表達水平部分恢復

相較于Ad-HBx處理組，Ad-siDnmt1組中DKK2蛋白表達水平上調5.21倍(P<0.05)，si-Dnmt3a組中DKK2蛋白表達水平上調1.98倍(P<0.05)(圖4)。

A.the protein expression of DKK2 after treatment with siDnmt1; B.the protein expression of DKK2 after treatment with siDnmt3a; *P<0.05 compared with Ad-GFP圖4 SMMC7721細胞中Dnmt1和Dnmt3a對DKK2表達的影響Fig 4 Effect of Dnmt1 and Dnmt3a on DKK2 expression in SMMC7721

3 討論

HBV病毒感染引起的慢性乙型肝炎是肝癌發生的常見致病因素，其編碼的蛋白眾多，其中以X蛋白的研究最為廣泛深入。既往研究發現HBx的反式激活功能可以對體內的細胞內信號傳導發揮重要作用，影響基因轉錄、表達和細胞分裂或增殖，從而在肝癌的發生進展中發揮關鍵作用[6]。DKK2是Wnt/β-catenin信號通路的負性調節因子， 已發現其在包括肝癌、腎癌、皮膚癌、不同星形腸癌等多種腫瘤中可出現異常表達[7-8]。然而，HBx是否通過影響DKK2的表達而導致肝癌的發生，目前仍不清楚。

本研究首次發現HBx引起DKK2在肝癌細胞系中表達下降，應用甲基化酶抑制劑處理肝癌細胞后DKK2表達有所上調，表明DKK2可能由于表觀遺傳修飾而被抑制。肝癌的發生是一個復雜的過程，涉及多種表觀遺傳異常。其中，啟動子DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳事件，導致肝癌中眾多抑癌基因的沉默。抑癌基因甲基化水平升高是肝癌的一個重要標志，并與肝癌的發生、發展密切相關。有研究認為，相較于人正常肝組織，在肝癌組織中DKK3 mRNA表達水平降低，甲基化發生率、甲基化水平更高，提示DKK3啟動子高甲基化可能是肝硬化向肝癌轉變的一個重要事件[9]。HBx通過甲基化沉默腫瘤組織中的SFRP1和SFRP5的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進肝癌進展的發生[10]。

DNA甲基化是主要由DNA甲基轉移酶(Dnmts)家族產生和維持的可逆化過程，抑制Dnmts可以作為治療腫瘤的靶標[11]。DNA甲基轉移酶家族包括Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b，其中Dnmt1負責維持甲基化，可作用于幾乎所有體細胞中存在的半甲基化底物上。研究顯示，腫瘤組織中Dnmt1的表達相比于非腫瘤組織有所升高[12]。本研究觀察到HepG2細胞系中DKK2的下調和甲基化轉移酶Dnmt1的過表達呈正相關，這與既往研究結果一致。Dnmt1或Dnmt3a的沉默幾乎完全消除了HBx誘導腫瘤抑制基因的DNA甲基化的潛力[13]，表明HBx對腫瘤抑制基因的啟動子過度甲基化需要這兩種酶的調控。其原因可能為HBx通過E2F位點上調啟動子活性來激活Dnmt 1的表達[14]。此外，Dnmt抑制劑通常通過上調腫瘤抑制因子如p14、p16和p21來抑制細胞增殖[15]。由于抑制Dnmt可導致高甲基化基因的去甲基化，因此推測Wnt通路負調節因子的高甲基化所致的基因下調可能是Wnt/β-catenin活化的原因之一。Wnt/β-catenin下游通路分子(如β-catenin、c-Myc、cyclin-D1等)的變化有待于進一步研究驗證。

本研究表明HBx可通過調控DNA甲基轉移酶1,3a來下調DKK2的表達，進而從表觀遺傳學的角度初步闡明了HBV相關肝癌的可能發生機制，為干預治療靶點的探索提供了新的理論依據。