miR-17-5p靶向乙醛脫氫酶2減少肺炎鏈球菌誘導的人肺腺癌肺泡基底上皮細胞系A549損傷

李維維，葛 斌，鄧 濤*，唐建軍，駱財元，馮圣芳，毛 羽

(成都市郫都區人民醫院 1.兒科； 2.檢驗科， 四川 成都 611730)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)在自然界中廣泛存在，嚴重威脅人類健康。感染S.pneumoniae易引起肺炎的發生[1]。肺泡上皮細胞是一種覆蓋在肺組織肺泡上的一層細胞，肺泡上皮細胞凋亡是肺炎發生的主要病理變化[2]。研究表明，機體的炎性反應參與肺炎的發展過程[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為18～25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，可在轉錄后抑制或降解mRNA，進而調控細胞的增殖、凋亡等生物學過程，與疾病的發生和發展密切相關。過表達miR-17-5p可通過調控Bax和Bcl-2蛋白，損傷大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞系PC12，促進其凋亡[4]。H2O2誘導心肌細胞損傷后，miR-17-5p表達水平顯著升高，高表達的miR-17-5p可加重H2O2誘導的心肌細胞的損傷[5]。但miR-17-5p在S.pneumoniae誘導的肺泡上皮細胞損傷中的表達及其對S.pneumoniae誘導的肺泡上皮細胞損傷的影響及其作用機制還未知。生物信息學軟件預測顯示，乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是miR-17-5p的靶基因。ALDH2是NAD(P)+依賴性酶，參與調控細胞的增殖、凋亡等生命過程。研究顯示，過表達ALDH2可通過清除脂質過氧化產物，保護高氧誘導的肺泡上皮細胞損傷[6]。但目前，miR-17-5p能否通過調控ALDH2表達影響肺泡上皮細胞損傷還未知。本研究主要探討miR-17-5p對S.pneumoniae誘導的肺泡上皮細胞A549炎性因子IL-6和IL-10及凋亡的影響及其能否通過調控ALDH2表達發揮作用，以期為肺炎的靶向治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞: 人肺腺癌肺泡基底上皮細胞系A549(human lung adenocarcinoma alveolar basal epithelial cell line A549)和肺炎鏈球菌BAA-255(S.pneumoniae)(ATCC公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒： 胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；RPMI 1640培養基(北京索萊寶科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑盒(Invitrogen公司)；Trizol試劑、反轉錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；PCR引物序列、miR-17-5p抑制劑和模擬物(mimics)及各自的陰性對照(上海生工生物工程有限公司)；CXCL16表達質粒和空質粒(Addgene公司)；抗-ALDH2抗體(艾美捷生物科技有限公司)；Bcl-2和Bax抗體(Santa Cruz公司)；白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)酶聯免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養和分組處理：復蘇A549細胞，加入含10% FBS的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2、97%濕度的培養箱中培養。待細胞匯合至80%左右時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，更換新鮮培養基，進行傳代培養或用于后續實驗。取對數增殖期的A549細胞分為對照組、感染組(1×108CFU/mL 的S.pneumoniae干預24 h[7])、anti-miR-17-5p干預組(S.pneumoniae感染前轉染anti-miR-17-5p)、anti-miR-NC干預組(S.pneumoniae感染前轉染anti-miR-NC)、pcDNA-ALDH2干預組(S.pneumoniae感染前轉染pcDNA-ALDH2)、pcDNA干預組(S.pneumoniae感染前轉染pcDNA)、anti-miR-17-5p與si-NC共同干預組(S.pneumoniae感染前共轉染anti-miR-17-5p和si-NC)，anti-miR-17-5p與si-ALDH2共同干預組(S.pneumoniae感染前共轉染anti-miR-17-5p和ALDH2小干擾RNA)。轉染具體步驟按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行操作。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-17-5p與ALDH2 mRNA水平：各組處理后的細胞，預冷PBS清洗后，Trizol試劑提取總RNA，微量核酸儀檢測RNA純度和濃度。用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：miR-17-5p上游5′-CAAAGTGCTTACAGTGCAGGAAG-3′，下游5′-CGGCGAATGCGTGCGCCTGC-3′；U6上游5′-CC GGTGAAAGTCGACAGCTGAC-3′，下游5′-GTGTCC GCGCGGATAAAGTCG-3′；ALDH2上游5′-CCGAA AGTGCTGCTGACACGCGC-3′，下游5′-GTCCGAAA CGCCGTGTCCC-3′；GAPDH上游5′-GGTCACCAGG GCTGCTTT-3′，下游5′-GGATCTCGCTCCTGGAA GATG-3′。擴增條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進行45個循環。miR-17-5p以U6為內參，ALDH2以GAPDH為內參，2-△△Ct法計算miR-17-5p與ALDH2 mRNA的相對表達水平。

1.2.3 Western blot檢測ALDH2、Bcl-2和Bax蛋白表達：處理后的細胞，預冷的PBS清洗后，加入細胞裂解液提取總蛋白。BCA法測定蛋白含量。取30 μg蛋白，加入適量上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE。電泳結束后，電轉移至PVEF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。然后分別加入兔抗人ALDH2(稀釋度1∶400)、兔抗人Bcl-2(稀釋度1∶200)和兔抗人Bax(稀釋度1∶200)抗體，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入羊抗鼠HRP標記的二抗(稀釋度1∶500)，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，加入ECL化學發光試劑，避光顯影，凝膠成像系統曝光拍照。以GAPDH為內參，Image J軟件分析蛋白條帶吸光度值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-17-5p與ALDH2之間的關系：生物信息預測結果顯示，ALDH2的3′UTR與miR-30b-3p的核苷酸序列存在結合序列，推測miR-17-5p可能調控ALDH2表達。構建ALDH2野生型質粒(WT-ALDH2)和ALDH2突變型質粒(MUT-ALDH2)。利用LipofectamineTM2000試劑盒將WT-ALDH2、MUT-ALDH2質粒分別與miR-17-5p mimics及陰性對照共轉染至A549細胞，5 h后，更換新鮮培養基，繼續培養至48 h。參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 酶聯免疫吸附劑(ELISA)檢測酶IL-6和IL-10水平：處理細胞后，收集細胞培養上清液，3 500 r/min離心10 min，上清液-20 ℃保存備用。參照IL-6和IL-10 ELISA試劑盒操作說明書，檢測各組細胞培養上清液中IL-6和IL-10水平。

1.2.6 流式細胞計量術檢測細胞凋亡率：分別取106個處理后的細胞，預冷的PBS清洗，吸棄上清液，加入500 μL結合緩沖液，輕輕吹打混合均勻，制成單細胞懸液。然后依次加入5 μL annexin V和5 μL的PI，室溫避光染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-17-5p和ALDH2在S.pneumoniae誘導的A549細胞中的表達

與對照組比，感染組miR-17-5p水平顯著升高(P<0.05)，ALDH2 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)(圖1，表1)。

圖1 Western blot檢測ALDH2蛋白表達Fig 1 Western blot detected expression of ALDH2 protein

表1 miR-17-5p和ALDH2在S.pneumoniae誘導的A549細胞中的表達Table 1 Expression of miR-17-5p and ALDH2 in S.pneumoniae-induced A549 cells

2.2 miR-17-5p靶向調控ALDH2的表達

ALDH2的3′UTR中含有與miR-17-5p互補的核苷酸序列(圖2)。miR-17-5p mimics可降低WT-ALDH2質粒的熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-ALDH2質粒的熒光素酶活性無顯著影響(表2)。miR-17-5p組ALDH2蛋白表達顯著低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-17-5p組ALDH2蛋白表達顯著高于anti-miR-NC組(P<0.05)(圖3，表3)。

圖2 ALDH2的3′UTR中含有與miR-17-5p互補的核苷酸序列Fig 2 The 3′UTR of ALDH2 contains a nucleotide sequence complementary to miR-17-5p

表2 雙熒光素酶報告實驗Table 2 Dual luciferase reporter

圖3 Western blot檢測ALDH2蛋白表達Fig 3 Western blot detected expression of ALDH2 protein

表3 miR-17-5p調控ALDH2蛋白的表達Table 3 miR-17-5p regulated the expression of

2.3 抑制miR-17-5p表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞損傷的影響

與對照組比，感染組IL-10和Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、IL-6和Bax水平顯著升高(P<0.05)。與anti-miR-NC干預組比，anti-miR-17-5p干預組IL-10和Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，miR-17-5p、凋亡率、IL-6和Bax水平顯著降低(P<0.05)(圖4，表4)。

A.Western blot analysis of apoptosis-related protein expression; B.apoptosis flow pattern圖4 抑制miR-17-5p表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞凋亡的影響Fig 4 Effect of inhibition of miR-17-5p expression on apoptosis of A549 cells induced by S.pneumoniae

表4 抑制miR-17-5p表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞損傷的影響Table 4 Effect of inhibition of miR-17-5p expression on S.pneumoniae-induced A549 cell

2.4 ALDH2過表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞損傷的影響

與pcDNA干預組比，pcDNA-ALDH2干預組ALDH2蛋白水平、IL-10和Bcl-2水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率、IL-6和Bax水平顯著降低(P<0.05)(圖5，表5)。

圖5 Western blot檢測ALDH2和凋亡相關蛋白表達Fig 5 Western blot detected expression of ALDH2 and apoptosis-related protein

表5 ALDH2過表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞損傷的影響Table 5 Effect of ALDH2 over-expression on S.pneumoniae-induced A549 cell

2.5 抑制ALDH2表達逆轉了抑制miR-17-5p表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞的損傷作用

與anti-miR-17-5p和si-NC共同干預組比，anti-miR-17-5p與si-ALDH2共同干預組ALDH2蛋白水平、IL-10和Bcl-2水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率、IL-6和Bax水平顯著升高(P<0.05)(圖6，表6)。

圖6 Western blot檢測ALDH2和凋亡相關蛋白表達Fig 6 Western blot detected expression of ALDH2 and apoptosis-related protein

表6 干擾ALDH2表達逆轉了抑制miR-17-5p表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞損傷Table 6 Interfering with ALDH2 expression reversed the inhibitory effect of miR-17-5p expression on S.pneumoniae-induced A549 cells

3 討論

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與調控肺炎、心血管疾病、腫瘤等各種疾病的發生和發展[8-10]。Ⅱ型肺泡上皮細胞在肺功能的維持、組織修復及免疫調節中發揮重要作用，由于A549細胞系具有Ⅱ型肺泡上皮細胞的結構和生化特征，被廣泛應用于Ⅱ型肺泡上皮細胞模型[11]。本研究顯示，S.pneumoniae誘導A549細胞后，miR-17-5p表達水平顯示升高，提示miR-17-5p參與肺炎的發生過程。肺炎發生過程中，肺組織或細胞炎性因子的合成和釋放增加[12]。促炎因子IL-6及抗炎因子IL-10參與肺炎的發展過程。如重癥肺炎患者血清中IL-6表達水平升高，IL-10表達水平降低[13]。本研究顯示，S.pneumoniae誘導A549細胞后，細胞培養上清液中IL-6水平升高，IL-10水平降低；而抑制miR-17-5p表達，降低了A549細胞IL-6的分泌，促進了IL-10分泌；表明抑制miR-17-5p表達可能通過抑制炎性反應降低肺炎發展進程。肺泡上皮細胞的凋亡與肺炎的發生密切相關[14]。Bcl-2表達的增加可抑制細胞凋亡；而Bax表達的增加則促進細胞凋亡。本研究顯示，S.pneumoniae誘導A549細胞后，細胞凋亡率升高；而抑制miR-17-5p表達，S.pneumoniae誘導的A549細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減少，提示抑制miR-17-5p表達可能通過促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，從而降低S.pneumoniae誘導的A549細胞凋亡。

為了進一步探討miR-17-5p保護S.pneumoniae誘導的A549細胞損傷的分子機制，本研究利用生物信息學軟件預測顯示ALDH2的3′UTR中含有與miR-17-5p互補的核苷酸序列，雙熒光素酶報告實驗結果證實，miR-17-5p可與ALDH2的3′UTR靶向結合。此外，上調細胞中miR-17-5p表達后，ALDH2蛋白表達降低；而下調miR-17-5p表達后，ALDH2蛋白表達升高。表明miR-17-5p負調控ALDH2表達。ALDH2屬于乙醛脫氫酶家，主要參與乙醛的代謝。研究顯示，ALDH2可能通過降低JNK信號通路的活性抑制心肌細胞凋亡，保護心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌損傷[15]。本研究顯示，過表達ALDH2降低了S.pneumoniae誘導的A549細胞凋亡、Bax蛋白表達以及IL-6分泌，促進了Bcl-2蛋白表達和IL-10分泌，表明ALDH2參與肺炎炎性反應，其過表達抑制S.pneumoniae誘導A549細胞凋亡。本研究還顯示，抑制ALDH2表達降低了抑制miR-17-5p表達對S.pneumoniae誘導的A549細胞炎性因子IL-6和IL-10表達及細胞凋亡，提示miR-17-5p通過調控ALDH2表達，降低S.pneumoniae誘導的A549細胞炎性反應和凋亡。

綜上所述，抑制miR-17-5p表達，可降低S.pneumoniae誘導的肺泡上皮細胞A549炎性因子的表達及細胞凋亡，其作用機制可能與上調ALDH2表達有關，為肺炎的靶向治療提供了新思路。