3D打印鈦合金多孔材料對體外成骨細胞系MC3T3-E1的生物安全性

景 麗，史 文，曹 雨，劉瑞賽，劉 璐，李建宇，劉 輝*

(1. 天津市第三中心醫院 肝膽疾病研究所 天津市重癥疾病體外生命支持重點實驗室， 天津 300170；2.嘉思特華劍醫療器材(天津)有限公司 天津市骨植入物界面功能化與個性化研究重點實驗室, 天津 300190)

人工關節假體的設計開發一直是國內外醫療器材領域的研發熱點，其中研發的關鍵問題是如何選擇具有骨組織相容性的生物醫用材料。鈦合金材料由于具有突出的耐腐蝕性、較低的彈性模量及良好的生物相容性，成為近年來眾多生物醫用金屬材料的首選[1-2]。3D打印技術是一種與傳統加工方法截然不同的增材制造工藝，此工藝主要基于三維數據逐層打印出所需的實體模型，利用3D打印技術可以快速并準確地制作出滿足設計要求的開發產品[3]。本課題組將鈦合金材料(Ti6Al4V)用于骨關節假體的設計開發，利用3D打印技術將鈦合金粉料逐層疊加，并通過其內部設計的多孔結構，優化其材料的彈性模量，提高材料的細胞黏附性，旨在提高鈦合金假體材料與骨組織的整合性與相容性，從而滿足患者對假體生存率的要求。

本課題組前期通過阿卡姆公司的工業級金屬3D打印機，利用電子束熔成型技術 (electron beam melting, EBM)，設計了3種拓撲單元的多孔鈦合金打印結構，使其多孔結構的孔徑、孔隙率及彈性模量均利于骨組織的細胞長入與血管化要求。但作為金屬材料，鈦合金植入人體后也會析出一些金屬離子，這些金屬離子進入體液后可能會對人體造成損傷。因此，本實驗是在前期研究基礎上，制備上述3種拓撲結構多孔鈦合金材料的浸提液，并用于成骨細胞(osteoblast，OB)的體外培養，通過檢測材料浸提液孵育下成骨細胞的增殖與分化活性，觀察3D打印鈦合金多孔材料的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

利用阿卡姆工業級金屬3D打印機(Q20PLUS， Arcam公司)；MC3T3-E1成骨細胞系(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)。

DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；細胞增殖MTT試劑(上海麥克林生化科技有限公司)；HE染色試劑、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(北京雷根生物技術有限公司)；I型膠原(collagen I，Col Ⅰ)免疫熒光染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞系傳代培養：將成骨細胞系進行體外培養，加入DMEM高糖培養基，添加1.5 g/L NaHCO3、43.2 mg/L肌醇、8.82 mg/L葉酸、7.8 mg/L β-巰基乙醇，加入10%優質胎牛血清，置于6孔板內進行傳代培養，在37 ℃、5% CO2培養箱內孵育，傳至第2代用于后續實驗。

1.2.2 制備材料浸提液：通過電子束熔融成型(EBM)技術，在真空環境中采用電子束作為熱源來逐層融化鈦合金金屬粉末，以增材制造的工藝方法3D打印3種拓撲單元結構的鈦合金多孔支架材料。三維鈦合金打印試樣及最小單元拓撲結構如圖所示(圖1)，3種拓撲單元結構分別為3D打印庫中2.0 mm、2.25 mm及2.5 mm的Dode-Medium單元結構，各試件的尺寸保持一致，均為20 mm×20 mm×3.5 mm。3種鈦合金多孔材料的絲徑約300 μm，孔徑800～1 000 μm，孔隙率75%～80%，彈性模量440～760 MPa。

A.three-dimensional titanium alloy porous scaffold；B. minimum unit topology圖1 3D打印成型的鈦合金多孔材料及單元拓撲結構Fig 1 3D-printed titanium alloy porous material and its topological structure

將3D打印的鈦合金多孔支架材料置于醫用高壓鍋中，高溫、高壓滅菌消毒后，按照材料表面積/浸提液體積=(1 cm×1 cm)/1.25 mL的標準[4]，將鈦合金多孔支架材料完全浸泡于DMEM培養液中，并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中浸提，3種拓撲單元多孔材料的浸提時間都分設24、48、72及96 h，到達各浸提時間后，利用渦流振蕩器進行振蕩，吸取各組材料浸提液并過濾除菌，無菌保存備用。

1.2.3 細胞增殖活力測定：將傳代的成骨細胞系進行胰蛋白酶消化，調整細胞濃度為5×103個/L，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h。待細胞完全貼壁后，在每孔中添加100 μL鈦合金多孔材料浸提液，作為各材料浸提液組，每組設6個細胞復孔；另設6個細胞復孔，添加100 μL DMEM培養液，作為陰性對照組；再設6個細胞復孔，添加100 μL 2.5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxid，DMSO)溶液，作為陽性對照組。將各組細胞繼續培養48 h，取出培養板，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，于培養箱中孵育4 h，終止培養，倒板，加入150 μL DMSO溶液裂解，振搖15 min后，用酶標儀于波長490 nm處，測定各孔吸光度(A)值。并通過各組細胞的A值，計算細胞相對增殖率(RGR=實驗組吸光度值/陰性對照組吸光度值×100%)。依據細胞毒性評定標準[5]，對各組材料的細胞毒性進行評估：相對增殖率(relative growth rate， RGR)≥100%為0級，75%～99%為l級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0為5級，細胞毒性分級程度≤1為無毒性。

1.2.4 細胞形態學HE染色：用6孔板接種傳代的成骨細胞系，經各組材料浸提液、DMEM培養液(陰性對照)、2.5% DMSO溶液(陽性對照)孵育后，棄去上清并用PBS沖洗，加入95%乙醇固定(15 min)，蒸餾水浸洗，蘇木精染色(5 min)，蒸餾水浸洗，稀鹽酸酒精溶液快速分色后，淡氨水返藍(5 min)，蒸餾水浸洗，伊紅染色(10 min)，經乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下照相。

1.2.5 細胞堿性磷酸酶ALP活性測定：用24孔板接種傳代的成骨細胞系，經各組材料浸提液、DMEM培養液(陰性對照)、2.5% DMSO溶液(陽性對照)孵育后，取各組細胞培養上清液200 μL，利用微板法于520 nm處測定ALP活性，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.6 細胞免疫熒光染色：經各組材料浸提液、DMEM培養液(陰性對照)、2.5% DMSO溶液(陽性對照)孵育后，棄去上清用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定(20 min)，PBS洗后，0.5% Triton X-100孵育(30 min)，PBS洗，加入1% BSA封閉(30 min)，滴加Col Ⅰ一抗工作液(1∶200)，4 ℃過夜，PBS沖洗，避光條件下加入熒光標記的二抗工作液(1∶400)，室溫孵育(60 min)，棄去染液，PBS潤洗3次，熒光顯微鏡觀察并攝片，使用Image pro-Plus(IPP)軟件進行圖像分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖活力及材料毒性評價

各組材料浸提液孵育的成骨細胞增殖活躍，各浸提時間點下3組鈦合金多孔材料的細胞A值，與DMEM陰性對照組比較無顯著性差異，而DMSO陽性對照組孵育的成骨細胞A值顯著下降 (P<0.01) (圖2)。計算各組細胞的相對增殖率(RGR)，并依據細胞RGR評估各組材料浸提液的細胞毒性，結果顯示各組浸提液的細胞毒性程度均≤1 (表1)。

*P<0.01 compared with each extract experimental group；A.2.0 mm material extract group; B.2.25 mm material extract group; C.2.5 mm material extract group圖2 各組成骨細胞的增殖活力Fig 2 Cell proliferation activity of osteoblasts in each n=6)

表1 各材料浸提液組成骨細胞的相對增殖率Table 1 The relative growth rate (RGR) of osteoblasts in each extract n=6)

2.2 細胞HE染色結果

各組材料浸提液孵育后，可見成骨細胞生長旺盛、增殖活躍，細胞貼壁伸展、分布均勻，形態呈梭形、三角形或多角形，細胞間突起明顯，成鋪路石樣排列連接。各材料浸提液組與DMEM陰性對照組比較，成骨細胞生長狀態同步，細胞形態無顯著改變。DMSO細胞毒陽性對照組中，可見成骨細胞的數量顯著減少，胞質皺縮，胞體固縮變小，細胞間突起縮短或消失，細胞間連接斷裂 (圖3)。

圖3 各組成骨細胞的HE染色結果 Fig 3 HE staining of osteoblasts in each group (×400)

2.3 細胞ALP活性檢測結果

各組材料浸提液孵育后，成骨細胞分泌的ALP活性為7.97～9.13 U/L。各浸提時間點下3組鈦合金多孔材料的細胞ALP活性與DMEM陰性對照組比較差異無統計學意義，而DMSO陽性對照組孵育的成骨細胞ALP活性顯著降低 (P<0.01) (圖4)。

*P<0.01 compared with each extract experimental group；A.24 hous material extract group; B.48 hous material extract group; C.72 hous material extract group; D.96 hous material extract group圖4 各組成骨細胞的ALP活性Fig 4 ALP activity of osteoblasts in each n=6)

2.4 細胞Col Ⅰ熒光染色結果

各組成骨細胞的I型膠原蛋白(Col Ⅰ)陽性表達于細胞質中，呈紅色熒光均勻分布。各浸提時間點下3組鈦合金多孔材料的Col Ⅰ陽性細胞表達面積與DMEM陰性對照組比較無顯著性差異，而DMSO陽性對照組中Col Ⅰ陽性細胞表達面積顯著減少 (P<0.01) (圖5，6)。

圖5 各組成骨細胞的Col Ⅰ免疫熒光染色 Fig 5 Col Ⅰ immunofluorescence staining of osteoblasts in each group (×400)

*P<0.01 compared with each extract experimental group; A.24 hours material extract group; B.48 hours material extract group; C.72 hours material extract group; D.96 hours material extract group圖6 各組成骨細胞的Col Ⅰ表達水平Fig 6 Expression level of Col Ⅰ in osteoblasts of each n=6)

3 討論

在目前的骨植入研究中，常用的金屬植入材料主要包括不銹鋼、鈷合金及鈦合金等。其中，鈦合金材料具有耐腐蝕性高、力學性能好、彈性模量低、生物相容性佳等優點，成為植入領域中廣泛應用的生物醫用材料[6]。以往金屬材料的加工工藝常采用傳統的機械加工方式，不但工藝復雜、周期長、難度高，而且很難達到“個性化定制”的設計要求[7]。3D打印技術作為一種新興的增材制造工藝，可以快速并準確地制備出滿足個體設計要求的金屬植入材料的技術要求及安全性等方面尚缺乏權威的評價標準。

本課題組前期通過阿卡姆金屬3D打印機，以EBM技術打印了3種拓撲單元的鈦合金多孔材料，使其結構參數與力學性能滿足骨長入及血管化要求。同時，經過前期體外離子析出實驗，發現鈦合金打印材料在浸提3～4 d內，鈦、鋁、釩3種金屬離子析出量快速增加，而這些離子可能會對人體造成損傷。因此，為了評價上述3種拓撲結構鈦合金打印材料的生物安全性，本實驗通過制備各組鈦合金多孔材料的浸提液，用于成骨細胞系MC3T3-E1的體外培養，觀察各材料浸提液對成骨細胞增殖與分化活性的影響。

本實驗首先從形態學方面，通過HE染色觀察各材料浸提液孵育下成骨細胞的生長狀態，結果發現各組材料浸提液并不影響成骨細胞的生長，成骨細胞依然貼壁牢固，并顯示良好的增殖活性，與DMEM孵育的陰性對照組比較，各組細胞生長狀態無差異。MTT實驗是通過檢測線粒體呼吸鏈的琥珀酸脫氫酶活性，反映細胞增殖活力的檢測技術。本課題組通過MTT法檢測各材料浸提液組成骨細胞的增殖活力。實驗結果表明，各組材料浸提液并不減緩成骨細胞的增殖速度，與DMEM孵育的陰性對照組比較，各組細胞增殖率無顯著差異，同時通過計算其相對增殖率，評價各組材料的細胞毒性，結果提示3D打印的3種鈦合金多孔材料對成骨細胞無毒性。

ALP是成骨細胞早期分化的重要標志物，在骨重建中發揮水解磷酸脂的作用，促使磷酸基團與鈣離子結合，啟動骨組織的鈣化過程，從而促進新生骨的形成[9-10]。Col Ⅰ是骨基質的主要組成部分，是由成骨細胞分泌的特異性膠原蛋白，成骨細胞礦化功能的實現依賴Col Ⅰ蛋白形成的網狀結構[11-12]。本實驗結果表明，各組鈦合金多孔材料浸提液并不影響成骨細胞的ALP分泌和Col Ⅰ表達，且與DMEM陰性對照組成骨細胞比較無顯著差異，提示3種鈦合金多孔材料不會影響成骨細胞的分化活性。

綜上所述，本課題組設計的3種鈦合金多孔打印材料，其浸提液對成骨細胞的增殖與分化活性無影響，顯示其良好的生物安全性。誠然本實驗還存在一定的局限性，由于體外浸提實驗的周期較短，無法觀察金屬材料長期植入的生物安全性。因此，本課題組將通過動物原位植入實驗，進一步驗證鈦合金多孔材料對骨組織細胞的生物安全性。