去氫木香內酯抑制人肝癌細胞系HepG2增殖及促凋亡

苗加偉，陳 潔，鄧雪松,2，熊 書,2，李國利,2，馬 強,2*

(1.重慶三峽醫藥高等?？茖W校 基礎醫學部， 重慶 404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心， 重慶 404120)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全世界復發率高且預后不良的惡性腫瘤之一[1]。盡管手術治療是目前治療肝癌最為有效的手段，但病死率仍較高，5年生存期僅60%[2]。肝臟移植價格昂貴，但供體來源缺少，難以推廣。因此，尋找有效且耐藥性小的治療藥物一直是研究的熱點。

木香為國內外常用藥材，應用歷史悠久[3]。去氫木香內酯(dehydrocostus-lactone，Dehy)為木香揮發油中含量較高的倍半萜內酯，亦是木香的主要生物活性成分[3]。Dehy具有廣泛的生物學效應，如抗感染、抗菌、改善胃腸功能以及抗腫瘤作用，如白血病、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等[4-7]。因此，推測Dehy可能是一種潛在的治療癌的藥物。但目前Dehy是否對肝癌細胞具有一定的抗癌活性尚不清楚?；诖?，本研究旨在探討Dehy對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的作用及其機制，為肝癌的藥物治療提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌 HepG2細胞系(中國科學院上海細胞庫)；去氫木香內酯(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，用DMSO配成100 mmol/L的儲備液，臨用前用完全培養基稀釋到所需濃度)；DMEM培養基(Hyclone公司)；胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)；DMSO和MTT試劑(Sigma-Aldrich公司)；總蛋白提取試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；核蛋白提取試劑盒、Hoechst 33258染色液和4%多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；彩色預染蛋白Maker(Biosharp公司)；超敏ECL化學發光顯色液(蘇州新賽美生物科技有限公司)；兔抗p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、β-actin及PCNA一抗(Santa Cruz公司)；山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組：將HepG2細胞置于DEME培養基中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度下的恒溫培養箱中培養。當貼壁細胞鋪滿底部90%左右時，加0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數增殖期細胞進行實驗。分為對照組(未加藥，含0.1% DMSO)及Dehy各劑量組(終濃度分別為10、20、30、40和50 μmol/L)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖率：1×105個/mL的單細胞懸液接種到96孔板中，每孔100 μL，培養至細胞單層鋪滿孔底，棄去培養基。按上述分組加藥處理細胞(對照組用完全培養基代替藥物)，100 μL/孔。24、48及72 h后，加入0.5% MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后小心吸除培養基，加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低速振蕩至結晶物充分溶解。用酶標儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度(A值)。計算細胞抑制率=(對照組A值-各藥物組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色檢測細胞凋亡：于6孔板中(孔底預置無菌蓋玻片)加入濃度為1×105個/孔的對數增殖期單細胞懸液2.5 mL，過夜培養貼壁后，加藥培養48 h后，棄去培養基，加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，用PBS洗凈固定液，加入0.5 mL Hoechst 33258工作液(5 mg/L)，室溫避光染色10 min，去除染色液，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核的變化，拍照。細胞凋亡以細胞核呈藍色致密濃染作為陽性標準，鏡下每孔隨機選擇5個視野拍照，利用專業圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計數凋亡細胞數(陽性細胞)和細胞總數，計算細胞凋亡率=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.4 Western blot檢測NF-κB通路相關蛋白：將HepG2細胞以1×106個/瓶的濃度接種于細胞培養瓶中，待細胞貼壁后，實驗組分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的Dehy，對照組加入3 mL含0.1% DMSO的完全培養基，培養48 h后，分別收集各組細胞，加入預先配置的RIPA細胞裂解液(內含1%蛋白酶抑制劑PMSF及1%磷酸酶抑制劑)100 μL，提取總蛋白。按核蛋白提取試劑盒說明書的步驟提取核蛋白。按BCA蛋白檢測試劑盒操作流程測定蛋白濃度。每組取上樣總蛋白50 μg，按Wesetern blot 實驗步驟進行SDS-PAGE分離，電轉到PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉12 h后，TBST緩沖液清洗PDVF膜，然后加入人抗兔p-IκBα、IκBα、p-p65、p65、β-actin、PCNA一抗(1∶1 000)，于4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液漂洗，加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育3 h，TBST緩沖液漂洗后用ECL顯色劑顯色，曝光，掃膜拍照。以β-actin作為內參蛋白，PCNA作為核內參蛋白，通過吸光度分析軟件分析條帶吸光度值，比較各組間差異。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Dehy對HepG2細胞增殖的影響

與對照組比較，各濃度Dehy分別作用于HepG2細胞24、48和72 h后，細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且呈濃度和時間依賴性(表1)。因藥物在10、20和30 μmol/L的濃度時作用48 h后對細胞的增殖抑制率已經非常明顯，故下面的實驗均選取此濃度范圍及作用時間點。

表1 不同濃度和時間Dehy對HepG2細胞增殖的抑制作用Table 1 Effect of dehydrocostuslactone on proliferation inhibition of HepG2

2.2 Dehy對HepG2細胞凋亡的影響

與對照組相比，各藥物濃度組細胞的細胞核出現不同程度的致密濃染和固縮等凋亡現象(圖1)。隨著Dehy濃度的增加，凋亡細胞的數量也顯著增加(P<0.05或P<0.01)(表2)。

圖1 Dehy對HepG2細胞凋亡形態學的影響Fig 1 Effect of dehydrocostuslactone on apoptosis morphology of HepG2 cells (Hoechst 33258 staining，×200，n=5)

表2 各組HepG2細胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rates of HepG2 cells

2.3 Dehy對HepG2細胞NF-κB相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比，隨著Dehy濃度增加，細胞內p-IκBα和nuclear-p65(核內p65)蛋白表達水平明顯下調(P<0.05或P<0.01)，IκBα蛋白水平增高(P<0.05或P<0.01)，而total-p65(胞內總p65)蛋白表達未見明顯變化(圖2A～C)。

A.Western blot analysis of the p-IκBα, IκBα, nuclear p65 and total p65 protein levels at 48 hours in HepG2 cells, β-actin and PCNA was used as control; B.effects of dehydrocostuslactone on nuclear p65 and total p65 protein expressions in HepG2 cells; C.effect of dehydrocostuslactone on IκBα and p-IκBα proteins expression in HepG2 cells； *P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖2 Dehy對HepG2細胞NF-κB相關蛋白表達的影響Fig 2 Effect of dehydrocostuslactone on the expression of NF-κB related proteins in HepG2

3 討論

腫瘤形成是一個十分復雜的生物學過程，其生長取決于細胞增殖和凋亡之間的平衡[8]，而抗腫瘤藥物主要通過抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡發揮抗腫瘤作用[9]。Dehy含有的倍半萜類化合物結構能與含巰基的酶及其功能性蛋白酶發生反應，進而干擾細胞的代謝過程，具有多種藥理活性的化合物[5]。Dehy在10～50 μmol/L濃度范圍內對多種腫瘤細胞的增殖有較強的抑制作用[10]。本研究的細胞毒性結果表明，以上濃度的Dehy可明顯抑制HepG2細胞的增殖，并呈劑量和時間依賴性。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，表現為細胞皺縮、核染色質邊集、凋亡小體形成等，也可出現核固縮、核碎裂等壞死表現[11]。Dehy可誘導多種腫瘤細胞凋亡[6]。在本研究中，不同濃度Dehy作用于肝癌細胞后，均出現明顯的凋亡現象，且隨著藥物濃度增加，HepG2細胞的凋亡率顯著增加，提示Dehy誘導人肝癌細胞凋亡。細胞凋亡由多種細胞信號傳導通路相互“對話”(crosstalk)所介導[12]。NF-κB(nuclear factor-kappa B)是細胞內重要的核轉錄因子，參與調控細胞分化、增殖及凋亡等多種生理病理過程[12]。研究表明，NF-κB異常高表達與肝癌細胞的分化及患者的預后關系密切[13]。

抑制IκBα的磷酸化過程(減少p-IκBα生成)，可以影響p65的磷酸化，使NF-κB異源二聚體p65-p50不易進入細胞核，因而可抑制NF-κB通路的活化，明顯逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥[14]；抑制NF-κB信號通路的激活能夠促進肝癌細胞的凋亡[15]。本實驗中，不同濃度Dehy處理后的HepG2細胞，p-IκBα和nuclear-p65蛋白水平明顯下調，表明去氫木香內酯可下調HepG2細胞NF-κB通路，影響其下游基因轉錄，從而抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，去氫木香內酯可抑制人肝癌HepG2細胞增殖和誘導凋亡，其可能的機制是下調NF-κB通路。在后續研究中，將對去氫木香內酯的藥理作用及分子機制進一步深入挖掘，以期為去氫木香內酯的臨床應用提供初步資料。