食管腺癌細胞系及模型和3D培養的研究進展

劉董劍，楊 凌

(1.內蒙古醫科大學 研究生院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬醫院 臨床醫學研究中心，內蒙古 呼和浩特 010050；3.內蒙古自治區醫學細胞生物學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010050)

1 食管腺癌生物學特點

食管癌(esophageal carcinoma)是一種惡性侵襲性疾病，是癌相關致死性的常見原因之一，每年有多達幾十萬人死于這種癌。食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)在人群中的發病率較低，僅占食管癌的小部分。食管腺癌易發生于低位食管內，部分食管腺癌來自Barrett食管，其他來自食管內腺體的惡變。食管腺癌惡性程度不一，常分為低分化、高分化兩種類型腺癌。早期食管癌患者往往無明顯癥狀，易發生淋巴結轉移和遠處轉移，造成食管腺癌晚期患者不易治愈。食管反流物造成的炎性反應會刺激食管內膜化生，是常見的導致食管腺體惡變的因素之一，同時，遺傳因素、環境因素及飲食習慣等因素也都與食管腺癌的發生發展密切相關。高通量基因測序發現，食管腺癌細胞內基因組序列常伴發基因突變、缺失、重組及DNA甲基化。食管腺癌的染色體非常不穩定，易造成基因編碼錯誤及表達異常。此外。亞硝酸鹽、高熱食物等因素也容易導致食管腺細胞內DNA損傷及修復錯誤而增加突變頻率，造成食管腺細胞增殖異常及惡變。由此可知，腫瘤基因和分子水平調節異常對腫瘤的性質和侵襲性具有高度影響和相關性。

食管腺癌(esophageal adenocarcinoma)的增殖、分化、凋亡、遠處轉移及侵襲性，會受到細胞內信號傳導途徑傳導及調節因子表達的影響。隨著對食管腫瘤研究的推進，分子靶向藥物廣泛用于腫瘤的治療，Trastuzumab 和Ramucirumab是常用于治療食管腺癌的分子靶向藥物，其機制是通過抑制表皮生長因子受體及血管生長因子受體而抑制腫瘤的轉移，從而達到治療腫瘤的目的。此外，治療食管腺癌的方法還包括手術治療、放化療及免疫治療，但食管腺癌患者病死率依然很高。由于食管腺癌很難治愈，遠處轉移的概率很大，食管癌的科學研究和臨床治療依舊是一項艱巨任務。

因此，為了探索和研究食管腺癌細胞的生物特性及發生機制，食管腺癌模型的3D培養可以用于發現腺癌細胞潛在的微觀變化及癌變機制。本文綜述了近年來食管腺癌細胞系、移植模型、3D培養研究的最新成果。

2 食管腺癌細胞系

食管腺癌細胞系包括SKGT、OE、FLO-1、Eso及OACM 5.1C亞系。SKGT-4、SKGT-2是高分化腺癌， SKGT-5、OE19、FLO-1、ESO51、OE33、Eso26、EsoAd1及OACM 5.1C是低分化食管腺癌。食管腺癌細胞是會發生高度變異和分子水平表達異常的腫瘤。食管腺癌細胞在增殖及分化過程中易產生異質性，形成不同程度的結構及形態差異。同時，食管腺癌細胞易通過血管進入周圍循環而形成循環腫瘤，可被認為是腫瘤細胞轉移性播散的前兆。構建腺癌培養模型將成為食管腺癌研究和臨床治療的有利工具，特別有利于研究食管腺癌異質性和可塑性。食管腺癌細胞系亞型各自的特點見表1。

表1 食管腺癌細胞系特點Table 1 Characteristics of esophageal adenocarcinoma cell lines

2.1 低分化食管腺癌細胞系

OE19是食管腺癌細胞系亞型，呈現高度分化。腺癌細胞內常存在基因擴增或表達異常，并與腫瘤細胞所處的微環境密切相關。OE19細胞內PIK3CA基因呈現擴增，與腫瘤浸潤性T細胞顯著相關，KRAS擴增與淋巴結陽性患者和較差的總體生存率相關。PIK3CA或KRAS的基因擴增會誘導下游區域的AKT-mTOR或RAF-ERK通路的活化，而活化的AKT通路與炎性腫瘤微環境有關[1]。腫瘤的進展與食管腺癌周圍微環境的變化密切相關。因此，腫瘤微環境會影響腫瘤細胞的增殖及轉移，調節腫瘤微環境有利于推進腫瘤的治療及改善療效。辛伐他汀通過抑制COX-2和PGE2的表達而對OE-19腺癌細胞具有明顯的抑制作用，隨MDA水平的升高而升高。辛伐他汀對食管腺癌的治療可能具有重要的作用[2]。

OE33是低分化食管細胞系亞型。機體免疫應答對識別和殺死腫瘤起重要作用，而免疫功能異常容易導致腫瘤的發生。免疫檢查點抑制可能影響高度侵襲性癌細胞的增殖。miRNAs的過度表達會降低TAP1、TAP2的表達及細胞表面MHC-I的表達， 高表達量的TAP1和抗原提呈相關基因能促進調節適應性免疫應答基因PD-L1、PD-L2和IDO1的高水平表達。OE33腺癌細胞內MIR125a-5p和MIR148a-3p水平的增加可以降低抗原提呈所需的TAP2和MHC-I水平，EAC細胞內高表達的MHC-I分子可顯著縮短患者的總生存時間[3]。腫瘤細胞內小分子信號物質及表達會發生變化。microRNAs在許多惡性腫瘤相關的生物學過程中發揮著重要作用，包括細胞凋亡、代謝、增殖和分化[4]。miR-126是OE33細胞活性的調節因子。miR-126的穩定表達能顯著改變細胞凋亡和DNA修復相關基因的表達，及調節促凋亡和抗凋亡基因TP53和GATA6的表達。食管腺癌細胞內miR-126高表達可阻滯腫瘤細胞凋亡，并與患者生存率低有關[5]。

FLO-1是低分化食管腺癌細胞系亞型。RAD51是介導同源重組的DNA修復機制，在維持基因組完整性和穩定性方面起著關鍵作用。FLO-1腺癌細胞內RAD51的表達升高與DNA斷裂的修復和基因組重排有關，而中度抑制該基因可降低同源重組活性，然而強烈或甚至接近完全抑制該基因會激活涉及SSA機制、與RAD51C相關的同源重組活性。SSA是一種致突變的同源重組途徑，通過增加腫瘤細胞內DNA斷裂進一步破壞基因組完整性。RAD51是治療某些癌的潛在靶點[6]。TLRs是機體免疫系統的組成部分，與FLO-1細胞的增殖密切相關。通過TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信號通路，TLR4激活會促進腫瘤細胞增殖，而抑制NF-κB的途徑會導致降低腫瘤細胞的增殖速度。TLR4可能是抑制食管癌細胞增殖的靶點，對腫瘤的研究和治療具有重要價值[7]。

ESO51是食管腺癌細胞系亞型。ESO51細胞內存在上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)因子或HER2的過表達，與腫瘤的發展具有相關性。福林替尼對ESO51細胞的增殖具有明顯的抑制作用，達到EMT基因擴增和過表達的水平。福林替尼或siRNA特異性下調EMT表達會抑制EMT信號傳導誘導的ESO51細胞凋亡。HER2的異位表達會降低福林替尼對ESO51-HER2細胞介導的增殖抑制作用及ERK下游磷酸化[8]。福林替尼和拉帕替尼可有效抑制EMT和HER2磷酸化，通過誘導細胞凋亡增強對腫瘤細胞增殖的抑制作用，顯著提高整體的生存率。福林替尼和拉帕替尼對HER2陽性的EMT過度表達EAC患者的治療可成為一種新的治療腫瘤的策略[9]。

Eso26是食管腺癌細胞系亞型。腫瘤細胞內的信號分子受到抑制或放大，可影響腫瘤細胞的增殖、凋亡。CDK9抑制劑具有抗腫瘤作用，MCL-1是CDK9抑制劑的下游靶點。通過抑制HIF-1α與MCL-1啟動子結合，BAY1143572會下調MCL-1，并具有抗腫瘤增殖和促凋亡作用。5-FU能夠增強BAY1143572誘導MCL-1的下調，MCL-1的穩定過表達會降低BAY1143572和5-FU誘導的ESO26細胞凋亡。MCL-1是EAC治療的一個預測因子，與腫瘤患者的生存期密切相關[10]。SOX9是腫瘤治療的一個預后標志物，對腫瘤細胞的增殖和凋亡具有重要影響。通過抑制腫瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡，SOX9基因敲除能提高ESO26細胞對Trastuzumab的作用，并可以抑制AKT磷酸化。SOX9可能通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT信號通路而產生曲妥珠單抗抗性作用[11]。

EsoAd1是食管腺癌細胞系亞型。EsoAd1細胞內AR的核定位區和FKBP5的表達與食管癌患者生存率降低有關。FKBP5的表達與腫瘤細胞增殖呈正相關，FKBP5陽性細胞比例高的EAC細胞增殖指數高。二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)會誘導 FK506基因的表達，DHT通過腫瘤細胞內AR抑制增殖、細胞分裂、誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡。腫瘤細胞內的信號途徑異常激活與腫瘤的進展具有重要聯系。DHT會抑制腫瘤細胞增殖、分化及誘導抗原相關基因表達和細胞周期停滯[12]。

OACM 5.1C是食管腺癌細胞系亞型。OACM 5.1C細胞內galectin-9具有抗增殖作用。Gal-9可以誘導腫瘤細胞凋亡，增加細胞內caspase裂解的角蛋白18的表達水平、活化caspase-3及caspase-9。Gal-9能升高IL-8表達水平，顯著改變miRNA的表達，但不會通過降低細胞周期相關蛋白水平而促進細胞周期阻滯。因此，該研究對于EAC的臨床治療具有重要意義[13]。

SKGT-5是食管腺癌細胞系亞型。SKGT-5細胞內Notch信號會驅動表皮細胞的自我更新。SKGT-5存在完整激活腫瘤細胞內Notch的信號通路，腫瘤細胞內會表達NOTCH1-3，但不表達NOTCH4，暗示存在一個活躍的Notch信號通路[14]。食管腺癌內Rb、細胞周期蛋白D1、p16和p53基因的表達會發生變化。氟哌利多會誘導SKGT-5細胞周期阻滯和凋亡，細胞內周期蛋白D1、Rb和p107蛋白水平的表達會下降。細胞周期阻滯和腫瘤生長抑制與腫瘤細胞的基因型沒有明顯的相關性，氟哌利多對食管癌的治療很有前景[15]。

2.2 高分化食管腺癌細胞系

SKGT-4是高分化食管腺癌細胞系亞型。食管腺癌細胞內存在LncRNA XIST過度表達。XIST的表達可以顯著抑制SKGT-4細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導凋亡。腫瘤細胞內miR-494表達下調，會抑制p-JAK2和p-STAT3表達增加。XIST的異常表達可能通過JAK2/STAT3信號通路的miR-494/CDK6軸在食管癌的發生發展中起致癌作用，為腫瘤細胞的分子機制研究提供理論依據[16]。SIX3是一種人類細胞內的轉錄因子。SKGT-4細胞內SIX3高表達，與食管癌低存率有關，SIX3基因的敲除顯著抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。si-SIX3轉染腫瘤細胞后，PI3K/Akt信號通路中一些關鍵蛋白的表達明顯降低，可能導致PI3K/Akt信號失活。研究結果表明，SIX3對人腫瘤細胞具有潛在促進作用，可能是預測食管癌患者預后的生物標志物和治療靶點[17]。SKGT-2是食管腺癌細胞系亞型。SKGT-2細胞缺乏Rb表達，而腫瘤細胞內cyclin Dl 和活性p16 呈現中度表達[15]。

3 放化療抗性模型

腫瘤細胞對放化療的敏感性差異很大，易導致放療抗性。放化療也會改變腫瘤細胞結構及遺傳物質而產生適應性，從而影響治療效果。盡管有很多種方法治療腫瘤，但效果都不是很理想。放化療仍是治療腫瘤的常用方法。放化療模型不僅可以研究和探索腫瘤細胞抗性的原因，也有助于研究和探索腫瘤細胞基因信號通路及細胞因子調節的相關機制。食管腺癌抗性細胞系總結見表2。

表2 食管腺癌細胞系抗性特點Table 2 Resistance characteristics of esophageal gland cancer cells

3.1 化療抗性模型

OE19-ERBB和OE33-ERBB是食管腺癌細胞系亞型，會對曲妥珠單抗和帕妥株單抗產生抗性。腫瘤細胞內ERBB3呈高表達，TGFB1與ERBB3表達呈負相關。存在Trastuzumab培養的EAC細胞會降低上皮標志物表達，增加間充質標志物表達。不存在Trastuzumab培養的腫瘤細胞，會誘導EMT。與ERBB抑制劑培養的EAC細胞會分泌TGFβ受體配體，并導致EMT的發生。與曲妥珠單抗、帕妥株單抗培養的腫瘤會表達EMT標記，且腫瘤細胞分化較差，而存在曲妥珠單抗、帕妥株單抗及TGFβ抑制劑聯合作用培養的腫瘤細胞會表達上皮標記，腫瘤細胞分化程度較高。OE19或33細胞是通過激活TGFβ信號通路，對Trastuzumab和Pertuzumab產生抗藥性，從而誘導上皮細胞向間質細胞轉變，但阻斷TGFβ信號傳導會可提高單抗的抗腫瘤作用[18]。

3.2 放療抗性模型

FLO-1R、SKGT-4R、OE33R是食管細胞接受放療后產生抗性的食管腺癌細胞系亞型。細胞周期蛋白依賴性激酶9(CDK9)在細胞內轉錄水平上調控輻射誘導組織損傷的幾個核心蛋白和細胞途徑。BAY1143572是高特異性CDK9抑制劑，對食管腺癌的放射具有增敏作用。作為CDK9抑制的候選靶點，Axl在FLO-1和SKGT4細胞中的過表達會增強CDK9抑制劑的放射增敏性，CDK9抑制劑會提高OE33R食管腺癌對放射抗性的敏感作用。BAY1143572以 CDK9為靶點可顯著增強放療效應[19]。

OE33 Cis R腺癌細胞對放療產生抗性。食管腺癌是一種由炎性反應驅動的癌癥,OE33 Cis R細胞分泌的蛋白水平顯著改變。OE33 Cis R細胞ALDH1活性增加，轉化生長因子β信號、Wnt信號和類固醇生物合成顯著上調。Cisplatin抗性導致炎性反應因子IL-7分泌的水平增加，且耗氧率顯著升高。獲得性順鉑耐藥的同基因OAC模型的分子和表型變化為這項研究提供了新的見解，并突出了腫瘤細胞內順鉑耐藥的治療靶點[20]。

4 食管腺癌異種移植模型

食管腺癌異種移植模型分為原位移植模型、皮下移植模型和PDX模型(表3)。

表3 食管腺癌異種移植物模型Table 3 Xenograft models of esophageal adenocarcinoma

4.1 原位移植模型

食管腺癌原位移植模型是將食管腺癌手術標本或活檢組織植入免疫缺陷的小鼠食管內[21]，構建相似的腫瘤生長環境而建立的模型。原位移植模型能夠更好的反應腫瘤的細胞生物學特點，有利于研究腫瘤細胞的侵襲性和異質性。由于實驗復雜和移植難度大，食管腺癌的原位移植在科學研究中很少應用，更多被認為是一種理論模型。

4.2 皮下移植模型

食管腺癌皮下移植模型是將食管腺癌細胞移植入NOD-SCID小鼠皮下而構建移植模型。皮下移植模型能夠反應腫瘤細胞的異質性，是研究食管腺癌細胞增殖和侵襲的有力工具。雖然不能對腫瘤細胞進行多層次的研究，但皮下移植模型有助于分析食管腺癌細胞的增殖和代謝的機制。

OE33細胞接種NOD-SCID小鼠皮下成瘤。食管腺癌細胞內TGFβ和JNK信號通路過度激活，腫瘤組織磷酸化JUN和SMAD蛋白的核定位增強，受其調控的基因在EAC過度表達。通過移植模型中SMAD4的獨立方式，藥物抑制或敲除FLO-1或EsoAd1中的TGFβ或JNK信號成分，可以顯著降低小鼠的腫瘤細胞增殖、集落形成、細胞遷移或異種腫瘤的生長。阻斷TGFβ和JNK信號通路可能是治療EAC的策略[22]。其對于腫瘤的治療研究和探索提供了不同的途徑。

4.3 PDX模型

食管腺癌PDX模型是從患者的食管腺癌組織中分離出腺癌細胞，接種在NOD-SCID小鼠皮下成瘤所構建的模型。PDX模型可以用于臨床研究和藥物實驗，有助于了解食管腺癌細胞的生理病理學特點。相比于其他移植模型，用于研究的食管腺癌細胞直接來源于患者，研究腫瘤樣品易獲取，保留了腫瘤細胞原有的性質和特點。獲取的腫瘤細胞存在細胞分化差異，PDX模型的腫瘤細胞更易呈現異質性，為腫瘤研究提供了有力的研究材料。

食管腺癌細胞接種在NOD-SCID小鼠皮下構建PDX模型，用于評價治療腫瘤細胞的療效。精確照射會顯著延緩PDX模型的異種移植瘤生長，聯合放化療會進一步延緩生長。照射后，PDX模型顯示Hh轉錄的持續調節。5E1是一種單克隆SHH抗體，LDE225是一種抑制Hh(Hedgehog)信號通路的臨床SMO抑制劑。LDE225、輻射及單獨使用5E1的Hh反應性PDX模型中，單獨使用任何一種治療，都可延遲生長，但非反應性PDX模型中沒有呈現。表明，Hh信號傳導介導了EAC-PDX模型中的輻射反應，抑制該信號通路可能增強Hh依賴性腫瘤的輻射效應[23]。

食管腺癌細胞PDX模型為抗血管生成藥物的聯合化療提供了治療腫瘤的重要策略。PDX模型可以闡述血管內皮生長因子受體2(vascular end-othelial growth factor receptor 2，VEGFR2)針對腺癌血流動力學及藥物滲透的影響。長期抗VEGFR2治療的腫瘤會造成導致化療攝取減少的相對較低的流量和血管密度，短期的VEGFR2靶向治療則相反。短期抗血管生成治療通過誘導一氧化氮的合成和透明質酸的降解徹底重塑腫瘤基質，從而擴張血管，改善腫瘤內化療的傳遞。所確定的有針對性的機制，提高了直接選擇的抗血管生成治療聯合化療治療EAC的療效[24]。

5 3D培養

3D培養是通過微環境影響對細胞的功能和反應特點進行研究的平臺，對腫瘤細胞的研究和探索具有推動作用。腫瘤細胞具有很強的分化和克隆能力，往往會因細胞基因表達錯誤和缺失而形成異質性。腫瘤細胞的異質性給臨床研究和治療帶來了巨大的困難和挑戰。腫瘤細胞的增殖分化、凋亡轉移受到微環境變化的影響。因此，腫瘤的3D培養可以更好的研究和觀察腫瘤細胞生物學變化。3D類器官培養能夠復述細胞的特點和特征，對腫瘤研究具有重要作用。

類器官3D培養在腫瘤研究中得到越來越多的應用，為探索腫瘤細胞的性質及對微觀環境變化的影響提供了有力的工具。類器官培養能夠提供腫瘤細胞更接近增殖的體外環境，能夠更加容易調節和干涉腫瘤細胞增殖的微觀因素，便以觀察腫瘤的細胞生物學特點和惡變機制。類器官3D培養可以研究腫瘤細胞的分子水平的調節和表達異常，有助于深入研究腫瘤細胞多重因素間的作用靶點。此外，食管腺癌細胞內的分子表達異常會影響腫瘤的增殖和轉移。shRNA介導的MKK6基因敲除抑制類器官模型內OE33 和 OE19細胞增殖，MKK6抑制會導致轉錄因子SOX9水平降低。敲除CRISPR/Cas9和SOX9基因會導致EACs在3D器官培養中的增殖下降，腫瘤生長速度減慢。食管腺癌細胞內的分子表達異常會影響腫瘤的增殖分化[25]。

6 結論

食管腺癌移植模型對細胞功能和特點提供了一個不同的探索方式。腫瘤微環境能夠影響腫瘤細胞的信息傳導和信號途徑的激活，甚至可以引發腫瘤的惡性克隆和遠處轉移。腫瘤細胞的基因突變和mRNA分子表達異常會導致異質性和對放化療微環境的適應性。異種移植模型能夠研究食管腺癌細胞的生理病理學特點和腫瘤細胞異質性，但很少涉及多重因素和復雜微環境的相互作用。3D類器官培養能夠反應食管腺癌細胞的異質性和形態變化，有助于研究和探索腫瘤細胞微觀水平表達的問題，推動食管腺癌研究不斷向前邁進。