miR?203調控鋅指蛋白281表達對黑素瘤細胞增殖、遷移的影響

陳小波 豆倩影 黃立新

南陽市中心醫院整形外科，河南473000

微小RNA?203（miR?203）作為一種抑癌基因在惡性黑素瘤中低表達，可調控黑素瘤細胞增殖、遷移過程［1］。鋅指蛋白281（zinc finger protein 281，ZNF281）是鋅指蛋白的一種亞型，在惡性腫瘤或癌變細胞中高表達，有誘發腫瘤的作用［2］。研究［3］表明，miR?203 可抑制鋅指蛋白217 在結直腸癌中的表達，降低其致癌性。miR?203是否可調節黑素瘤中ZNF281蛋白水平，從而影響黑素瘤細胞的增殖及遷移目前尚未見報道。本研究以黑素瘤細胞系A375、M14為研究對象，探討miR?203對A375、M14細胞增殖、遷移的影響，并初步探討其機制，為臨床應用提供一定參考。

一、材料與方法

1.細胞系及主要試劑：人血管內皮細胞系ECV304、人黑素瘤細胞系M14（上海賓穗生物科技有限公司，批號分別為BSC?5107481307?01、BSC?504847958?01）；人黑素瘤細胞系A375、SK?MEL?28、SK?MEL?2（上海名勁生物科技有限公司，批號分別為CM?1030、CM?1813、CM?1811）。

miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA 第1 鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）［天根生化科技（北京）有限公司，批號分別為DP501、FP401、FP205?02］；LipofectamineTM2000 轉染試劑盒、miR?203 模擬物、miR?203模擬物陰性對照、miR?203抑制劑、miR?203抑制劑陰性對照（廣州銳博生物科技有限公司，批號分別為P0309、P0716、P0703、P5047、P3066）；CCK8 試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號C0037）；草酸銨結晶紫染色液（上海博谷生物科技有限公司，批號PT007）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、一抗ZNF281（抗兔）、內參GAPDH（抗兔）、二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體（美國Abcam公司，批號分別為ab228530、ab101318、ab181602、ab205718）。

2.細胞培養：各培養基添加胎牛血清制成含10%胎牛血清培養基4 ℃備用。ECV304、SK?MEL?28 細胞用RPMI1640 培養基培養，A375、M14 細胞用DMEM 培養基培養，SK?MEL?2 細胞用MEM 培養基培養，均置于CO2培養箱中37 ℃常規培養，待細胞密度達85%時擴大培養。收集各組細胞檢測miR?203 水平，采用與ECV304 差異較大的A375、M14細胞系進行下一步研究。

3.實驗分組及處理：生長良好的A375、M14細胞稀釋成2×104個/ml，分別接種于24孔板中，每孔500 μl，待細胞密度達50%時轉染。按照LipofectamineTM2000 轉染試劑盒說明書操作，實驗分5組：對照組（細胞正常培養）、miR?203模擬物對照組（加入50 nmoL/L miR?203 模擬物陰性對照）、miR?203 抑制劑對照組（加入50 nmoL/L miR?203 抑制劑陰性對照）、miR?203 模擬物組（加50 nmoL/L miR?203 模擬物）、miR?203抑制劑組（加50 nmoL/L miR?203抑制劑）。各組細胞置于37 ℃培養箱中培養24 h。

4.實時熒光定量PCR 檢測miR?203 表達水平：收集細胞，miRNA 提取分離試劑盒提取總RNA（200 ng），用miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒合成cDNA，PCR儀擴增miR?203、內參U6。miR?203 正向引物序列：5′?TGCTC TGAGGCGTCTAAGGCGTCCG?3′，反向引物序列：5′?CCCAA GCTTCACCTCCCAGCAGCACTTG?3′；內參U6 正向引物序列：5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，反向引物序列：5′?AAC GCTTCACGAATTTGCGT?3′。反應體系（20 μl）：50 mg/L cDNA 1 μl，10 μmol/L 正向/反向引物各0.5 μl，SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μl，雙蒸水8 μl。反應條件：95 ℃3 min，95 ℃10 s，61 ℃45 s，40 個循環。2－??Ct法計算細胞中miR?203 水平，??Ct=?Ct目的基因－?Ct內參。每次實驗設6 個復孔，重復3次實驗。

5.Western 蛋白免疫印跡法檢測細胞中ZNF281 水平：收集細胞，添加蛋白裂解液，4 ℃10 000×g離心20 min，吸取上清液，BCA 試劑盒測定蛋白總濃度。每孔上樣25 ng，聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，280 mA 轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對應加入一抗ZNF281（稀釋比例1/5 000）、內參GAPDH（1/5 000），4 ℃孵育過夜；加入對應二抗，室溫孵育1.5 h。蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。蛋白表達相對值=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值。每次實驗設6 個復孔，重復3次實驗。

6. CCK8 法檢測miR?203 對A375、M14 細胞增殖能力的影響：各組細胞培養24 h 后，稀釋成1 × 105個/ml，每孔100 μl 置于96 孔板中，分別于0、24、36、48、60、72 h 添加CCK8 試劑，繼續培養2 h，酶標儀450 nm 處檢測吸光度（A450），只添加培養基組作為空白對照，A450=A450實驗孔－A450空白對照孔。

7. Transwell 檢測miR?203 對A375、M14 細胞遷移能力的影響：調整細胞為5 × 103個/ml，每孔500 μl 接種于Transwell 小室中，培養48 h；取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色5 min，流動蒸餾水清洗，顯微鏡下拍照并計數，每個小室5 個不重復視野計數并取平均值為該組細胞遷移數量。每次實驗設6個復孔，重復3次實驗。

8. 雙熒光素酶鑒定miR?203 與ZNF281 的靶向關系：TargetScan 軟件（http：//www.targetscan.org/vert_72/）查找ZNF281 mRNA 的3′UTR 與miR?203 結合位點。設計合成ZNF281 的3′UTR 野生型（3′UTR?WT）和3′UTR 突變型（3′UTR?MUT），分別與miR?203模擬物或miR?203模擬物陰性對照（miR?203 NC）共轉染293T細胞，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測miR?203 NC+3′UTR?WT組、miR?203模擬物+3′UTR?WT 組、miR?203 NC+3′UTR?MUT 組、miR?203模擬物+3′UTR?MUT組熒光素酶活性。

9.統計學分析：采用統計學軟件SPSS 24.0進行數據分析。多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK?q法。P<0.05認為差異有統計學意義。

二、結果

1.血管內皮細胞系和黑素瘤細胞系miR?203表達水平比較：各細胞系中miR?203 表達水平不同（F = 39.501，P <0.05）。A375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2 中miR?203 表達（0.23±0.02、0.34±0.06、0.48±0.09、0.56±0.11）均顯著低于ECV304（1.01 ± 0.21），差異有統計學意義（q = 9.057、7.514、5.682、4.650，均P<0.05）。因此，選miR?203 表達量差異較大的黑素瘤細胞系A375、M14進行下一步研究。

2.血管內皮細胞系和黑素瘤細胞系ZNF281 表達水平比較：各細胞系中ZNF281 表達水平不同（F = 35.701，P <0.001）。A375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2中ZNF281蛋白表達（0.87±0.15、0.79±0.06、0.80±0.12、0.43±0.11）均顯著高于ECV304（0.29 ± 0.06），差異有統計學意義（q =8.794、14.434、9.311、2.737，均P<0.05）。見圖1。

3. 各組A375、M14 細胞miR?203 表達的情況：與對照組、miR?203 模擬物對照組、miR?203 抑制劑對照組相比，miR?203 模擬物組miR?203 水平較高（A375：q = 23.902、24.610、25.623；M14：q=7.595、7.183、7.321），miR?203 抑制劑組miR?203 水平較低（A375：q = 10.985、11.425、15.669；M14：q = 13.717、10.445、8.665），差異均有統計學意義（均P<0.05）。見表1。

4. miR?203 對A375、M14 細胞增殖的影響：36、48、60、72 h，與對照組、miR?203 模擬物對照組、miR?203 抑制劑對照組相比，miR?203模擬物組A375、M14細胞增殖水平降低（A375：q36h= 6.311、9.417、7.564，q48h= 6.225、4.583、4.407，q60h= 3.775、4.457、3.997，q72h= 2.725、2.456、2.305，M14：q36h= 4.085、5.991、5.114，q48h= 6.171、7.652、5.353，q60h=5.465、5.571、4.603，q72h= 4.351、4.830、4.719，均P < 0.05），miR?203 抑制劑組細胞增殖水平升高（A375：q36h= 3.037、2.790、2.975，q48h= 3.676、3.001、4.740，q60h= 2.623、2.509、2.600，q72h= 2.622、2.615、2.409，M14：q36h= 2.421、2.327、2.378，q48h= 2.622、3.181、2.559，q60h= 2.410、2.278、2.096，q72h=2.056、1.926、1.887，均P<0.05）。24 h 時，miR?203 模擬物組A375、M14細胞增殖水平顯著低于對照組、miR?203模擬物對照組、miR?203 抑制劑對照組（A375：q = 7.217、6.341、4.692，M14：q=4.656、6.114、4.974，均P<0.05）；miR?203 抑制劑組M14 細胞增殖水平顯著高于對照組、miR?203模擬物對照組及miR?203 抑制劑對照組（q = 5.289、5.661、4.426，均P<0.05），而miR?203 抑制劑組A375 細胞增殖水平與這3組差異無統計學意義（均P>0.05）。見圖2。

組別對照組miR?203模擬物對照組miR?203抑制劑對照組miR?203模擬物組miR?203抑制劑組F值P值miR?203 A375 1.00±0.13 0.98±0.12 1.02±0.09 3.41±0.21a b c 0.39±0.04a b c 487.632<0.001 M14 1.01±0.06 1.03±0.11 0.99±0.13 2.05±0.33a b c 0.45±0.08a b c 68.454<0.001遷移數量（個）A375 35.48±4.38 36.84±5.41 37.16±6.13 19.36±4.61a b c 69.52±5.95a b c 70.193<0.001 M14 42.62±4.51 43.16±5.61 45.16±8.65 29.52±5.69a b c 75.16±8.31a b c 37.350<0.001 ZNF281 A375 1.12±0.21 1.16±0.19 1.12±0.23 0.86±0.15a b c 2.15±0.21a b c 37.514<0.001 M14 0.76±0.13 0.82±0.19 0.73±0.21 0.47±0.08a b c 1.01±0.25 6.826<0.001

5.miR?203 對A375、M14 細胞遷移的影響：與對照組、miR?203 模擬物對照組、miR?203 抑制劑對照組相比，miR?203 模擬物組A375、M14 細胞遷移數量較低（A375：q =6.209、6.024、5.685，M14：q = 4.420、4.181、3.700，均P <0.05），而miR?203 抑制劑組A375、M14 細胞遷移數量較高（A375：q = 11.286、9.954、9.279，M14：q = 8.340、7.818、6.126，均P<0.05）。見表1。

6.miR?203對A375、M14細胞中ZNF281蛋白表達的影響：miR?203 模擬物組A375、M14 細胞中ZNF281 蛋白表達顯著低于對照組、miR?203模擬物對照組及miR?203抑制劑對照組（A375：q=2.468、3.036、2.319，M14：q=4.654、4.159、2.834，均P<0.05）。miR?203抑制劑組A375細胞顯著高于對照組、miR?203 模擬物對照組及miR?203 抑制劑對照組（q=8.495、8.563、8.101，均P<0.05），而miR?203 抑制劑組M14細胞與對照組、miR?203模擬物對照組、miR?203抑制劑對照組差異無統計學意義（q = 2.173、1.482、2.101，均P >0.05）。見表1、圖3。

圖4 miR?203 與ZNF281 的靶向關系 miR?203 與ZNF281 存在15 個結合位點，在靶向位點連續結合的10 個位點建立ZNF?281突變序列（ZNF?281?MUT）

7.初步分析miR?203與ZNF281的靶向關系：TargetScan初步預測發現，miR?203 與ZNF281 之間存在靶位點見圖4。根據靶向位點連續結合的10個位點建立ZNF?281突變型。熒光素酶實驗驗證二者的靶向關系顯示，miR?203 NC+3′UTR?WT 組（1.00±0.17）、miR?203模擬物+3′UTR?WT 組（0.48 ± 0.06）、miR?203 NC + 3′UTR?MUT 組（0.96 ±0.13）、miR?203 模擬物+ 3′UTR?MUT 組熒光素酶活性（0.98 ± 0.15）差異有統計學意義（F = 20.950，P < 0.001）。與miR?203 NC + 3′UTR?WT 組相比，miR?203 模擬物+ 3′UTR?WT組細胞熒光素酶活性下降（q=7.065，P<0.05）。

三、討論

目前，治療惡性黑素瘤的常用方法為手術治療，無法進行手術治療的部分患者多采用放化療，但效果不佳且有不良反應，因此尋找安全、有效的治療方法是當前的臨床熱點。miR?203存在于染色體的不穩定脆性區域，是近年來發現的第一個皮膚特異性miRNA，其在轉移性黑素瘤及黑素瘤細胞系中低表達，過表達miR?203 可抑制黑素瘤細胞運動、集落形成以及血管生成誘導能力；在體內，miR?203還抑制異種移植腫瘤生長，并減少淋巴結和肺轉移；可作為黑素瘤的有效抑制劑［4］。本研究發現，黑素瘤細胞系A375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2中miR?203表達水平顯著低于血管內皮細胞系ECV304，提示miR?203水平降低可能與惡性黑素瘤發生發展有關；A375、M14 細胞中，上調miR?203表達可降低細胞增殖活性及細胞遷移數量，下調其表達可增加細胞增殖活性及細胞遷移數量，表明miR?203 可調控A375、M14細胞增殖及遷移過程，抑制其表達可降低黑素瘤細胞增殖及遷移活性。

ZNF可通過促進細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成，抑制細胞凋亡、自噬及溶酶體生成等，介導腫瘤發生發展［5］。ZNF217高表達于結直腸癌組織中，且與結直腸癌患者的低生存率有關，而miR?203可通過抑制ZNF217表達降低結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲活性，從而緩解癌癥進展［3］。抑制ZNF281 基因表達可降低直腸癌細胞活力并誘導細胞凋亡，且可增加及氟尿嘧啶化療敏感性［6］。環狀RNA circAGFG1 可與miR?203 競爭性地調控ZNF281 表達，通過circAGFG1/miR?203/ZNF281軸促進非小細胞肺癌的上皮間充質轉化和轉移［7］。ZNF281作為DNA結合蛋白，在腫瘤中研究較少，目前尚未見ZNF281在黑素瘤中的相關報道。本研究顯示，黑素瘤細胞系A375、M14、SK?MEL?28、SK?MEL?2中ZNF281 蛋白表達顯著高于血管內皮細胞系ECV304，提示ZNF281可能與黑素瘤的發生發展有關。下調A375、M14細胞miR?203 表達，可引起ZNF281 蛋白表達、細胞增殖活性及遷移細胞數均降低；上調A375細胞miR?203表達，引起ZNF281 蛋白表達、細胞增殖活性及遷移細胞數增加，提示miR?203 可能通過調控ZNF281 蛋白表達，影響黑素瘤細胞的增殖和遷移。M14細胞中，上調miR?203表達可引起細胞增殖活性升高、遷移細胞數增加，但ZNF281 蛋白表達未見明顯變化，可能與ZNF281蛋白受多種調控及不同黑素瘤細胞系的特性有關。進一步采用雙熒光素酶鑒定miR?203與ZNF281的靶向關系顯示，miR?203與ZNF281之間存在靶位點，miR?203 可能直接調控ZNF281。本研究只初步研究了兩個黑素瘤細胞系中miR?203 與ZNF281 的關系及其對細胞增殖、遷移的影響，還應進一步通過上調或下調ZNF281表達進行驗證，以進一步探索miR?203 調控惡性黑素瘤發生發展的機制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突