紫皮豇豆總多酚提取工藝研究及組分分析

吳瓊 王明月 葛會林 馬晨 呂岱竹

摘要：[目的]采用溶劑萃取法提取紫皮豇豆中的總多酚，多酚提取物經大孔樹脂分離純化，再利用高效液相色譜（HPLC）分析其多酚類化合物的組成及含量，為紫皮豇豆中多酚類物質的提取、分析提供理論依據。[方法]以總多酚提取量為考察指標，采用單因素和正交試驗，分析提取溶劑、料液比、溫度和pH對紫皮豇豆總多酚提取量的影響，再通過SephadexLH-20大孔樹脂對粗提物進行分離純化，并建立紫皮豇豆中6種多酚類組分的HPLC分析方法，采用外標法定量。[結果]紫皮豇豆中總多酚的最佳提取工藝為：經料液比1：5（m：V）的80%丙酮水溶液，在4C、pH6條件下，提取3次，每次提取5h時，所得的總酚含量最高為614mg（GAE）.100g。在優化的試驗條件下，沒食子酸、沒食子兒茶素、綠原酸、蘆丁、p-香豆酸和阿魏酸等6種多酚單體在相應的濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數（r）為0.9959～0.999，方法檢出限和定量限分別為0.1～1mg：100g和0.2～2.5mg：100g;加標試驗平均回收率74.3～107%，相對標準偏差0.4～8.6%。經HPLC分析，紫皮豇豆中6種多酚單體均有檢出，含量在0.46～6.5mg：100g"，其中含量最高的是蘆丁。[結論]采用80%丙酮水溶液提取紫皮豇豆總多酚，并利用HPLC法測定紫皮豇豆中幾種單體酚的方法提取率高、準確性好，適用于紫皮豇豆中多酚類化合物的提取及定性定量分析。

關鍵詞：紫皮豇豆;多酚;提取純化;成分分析

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）060673-09

0引言

[研究意義]海南產紫皮豇豆（PurpuraRubrumVignaUnguiculataSubsp.Cylindrica）為短莢豇豆，豆莢長約25～30cm，耐熱適合夏季種植。紫皮豇豆中除含有易于消化吸收的優質蛋白質、豐富的脂肪膳食纖維等營養物質外叫，還含有豐富的多酚類化合物引，有健脾補腎、消脂降糖及促進胃腸道蠕動等功效，是一種優質的稀有蔬菜，具有較高的保健價值。盡管多酚廣泛存在于蔬菜、水果及茶葉等植物源性食物中，但是它在不同食物中的含量和結構有很大差異+-5，且相較于一般蔬菜，普遍認為深色蔬菜中的多酚類物質含量更高”一切。多酚（Plantpolyphenol）也稱植物單寧，是一類從植物源性食物中發現的，具有保健作用的物質，由多種環狀酚類化合物聚合而成，也被稱為“第七類營養素”按分子量和結構的不同主要分為兩大類，即多酚單體和由單體聚合而成的低聚或多聚體的單寧類物質。其中，多酚單體因具有抗氧化、清除亞硝酸鹽、調節肥胖、預防癌癥、心臟病等功效，近年來成為眾多學者廣為研究的對象0-。[前人研究進展]隨著科學技術的迅速發展，植物源性食物中多酚物質的提取方法得到不斷優化，其中，常用的是溶劑萃取法。陸廣念等2研究發現，長綠豇豆經75%乙醇超聲提取得到的總多酚含量為74.071mg100g，總多酚的含量在10種蔬菜中僅次于藕、大蒜和菠菜;林寶妹等！3優化了嘉寶果葉片總多酚的提取工藝，采用優化后的工藝提取嘉寶果葉片總多酚含量可達33.84%，比已報道的方法提取的嘉寶果葉片總多酚含量高23.63%;張東峰等叫采用80%甲醇溶液提取柑橘果皮及果肉中的多酚，并對比了其中不同柑橘品種的總多酚含量，其中柑橘果皮的多酚含量（GAE）為2477～4748mg100g，其中以塔羅科血橙皮中多酚含量最多。本課題組前期通過浸提的方法獲取多酚、花色苷和磷脂，發現紫皮豇豆中的多酚類物質體外降糖效果較好，總多酚含量與a-葡萄糖苷酶抑制活性存在顯著正相關性，提高提取物中總多酚含量可增強對a-葡萄糖苷酶的抑制活性以。[本研究切入點]已有文獻報道了長綠豇豆多酚的總含量，但對于紫皮豇豆中多酚類物質的提取工藝及組成分析尚未見報道。[擬解決的關鍵問題]為高效獲取紫皮豇豆多酚，本文采用單因素試驗和正交試驗設計通過溶劑提取的方法研究紫皮豇豆總多酚的提取工藝，建立測定紫皮豇豆中6種多酚單體的HPLC檢測方法，旨在為紫皮豇豆多酚類物質的提取、分析及新品種的選育與開發利用提供理論參考。

1材料與方法

1.1儀器、材料與試劑

1.1.1儀器設備sYNERGY2多功能微孔板檢測儀;晶安石英96孔酶標板;高效液相色譜儀配有紫外檢測器（Waterse2695）;色譜柱（WatersPAHC185um，4.6X250mmColumn）;玻璃層析柱（5X25cm）;微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;高速冷凍離心機（HITACHICR22N）;冷凍千燥機（北京四環科學儀器有限公司）;AL204電子天平（感量0.0001g，瑞士Metler-Toledo公司）;SynergyUV超純水制備系統（美國Millipore公司）;移液槍以及其他實驗室常用儀器設備。

1.1.2試驗材料紫皮豇豆采自?？?，市售新鮮，品種為“八月豆”。

1.1.3試驗試劑標準品沒食子酸（Gallicacid）、沒食子兒茶素（GC）、綠原酸（Chlorogenicacid）、蘆?。≧utin）、p-香豆酸（p-Coumalicacid）和阿魏酸（Ferulicacid）標準品（純度》98.0%，購自源葉生物科技有限公司）;丙酮、甲醇和乙醇均為色譜純（美國ThermoFisherScientific公司）;SephadexLH-20（羥丙基葡聚糖凝膠）填料（美國GE公司）;試驗用水為MilliporeDirect-Q5超純水儀制備，甲酸等其它試劑為國產分析純。

1.2高效液相色譜條件

WatersPAHC18色譜柱（5um，4.6mmX250mm），柱溫：30C;流速1.00mL;min';進樣量：10p山;流動相A為0.2%（VV）甲酸水溶液，流動相B為乙腈;梯度洗脫程序：0～1min，10%A;1～4min，10%～25%A;4～1lmin75%～90%A;l1～15min，10%A;檢測波長：0～5.8min，278m;5.8～15min，327m。

2.1.2溫度對總多酚提取率的影響以80%的丙酮溶液為提取溶液，考察溫度對總多酚提取率的影響。由圖2可以看出，提取溫度為4C時紫皮豇豆總多酚的提取率最高為74.5%，隨著溫度提高提取率變化不大?？紤]試驗的實際操作，選取4C作為最佳的提取溫度。

2.1.3料液比對總多酚提取率的影響以80%的丙酮溶液為提取溶液，考察料液比對總多酚提取率的影響。由圖3可以看出，紫皮豇豆總多酚的提取率隨著料液比的增加而升高。當料液比為1g：5mL時，總多酚的提取率最大為78.1%，繼續增加提取溶劑量提取率變化不大，當料液比達到1g：10mL時出現總多酚提取率下降的趨勢?？紤]環境友好及試驗的經濟性，選取1g：5mL作為最佳的料液比。2.1.4pH對總多酚提取率的影響多酚類物質大部分呈弱酸性，因此，試驗選擇偏酸性條件考察pH對總多酚提取率的影響。從圖4可以看出，pH對紫皮豇豆總多酚的提取具有顯著的影響，pH=6時提取效果最好為78.6%。

2.2正交試驗結果與分析

2.2.1正交試驗結果由表3可知，通過極差分析得出影響紫皮豇豆總多酚提取量4個因素的主次關系為：A（提取溶劑）》D（pH）》C（溫度）》B（料液比），提取溶劑對反應的影響最大，對于收率指標的最佳工藝組合為ABjC，D，但因素C中水平2和3相差不大，本著節省成本、減少溶劑用量、降低環境污染的原則，本試驗選擇水平2作為提取條件。即最佳工藝組合為AjB，C，D，提取溶劑為80%丙酮，提取溫度為4C，料液比m欄品（g）：V溶訓（mL）=1：5，pH為6為最優提取條件。采用優化后的方法得到紫皮豇豆中的總多酚提取液，在45C下于旋轉蒸發儀中除去兩酮，剩余溶液經過冷凍千燥得到多酚提取物2.32g。

2.2.2正交試驗結果驗證按照最佳的反應條件做3次重復試驗，紫皮豇豆提取物中總多酚含量平均值為614mg（GAE）100g，高于表2中任何組合，相對標準偏差為0.6%，試驗結果的重復性很好，說明該試驗條件選取得當。

2.3檢測方法評價

2.3.1流動相的選擇采用0.2%（V/V）甲酸水溶液一乙腈為流動相，沒食子兒茶素等兒茶素類化合物、蘆丁等黃酮類化合物和沒食子酸、阿魏酸、綠原酸和p-香豆酸等酚酸類化合物各組分有良好的峰形且相較于不加甲酸的流動相有更好的響應值，對比圖見圖5。紫皮豇豆中的黃酮類和酚酸類多酚物質的共同特征是具有羥基或同時含有羥基與羧基等官能團，表現出一定的弱酸性，甲酸的加入有利于抑制多酚類化合物與色譜柱的靜電作用，減少拖尾，改善峰形。因此，試驗中選用0.2%（V/V）甲酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫。

2.3.2波長的選擇試驗發現沒食子酸和沒食子兒茶素的紫外吸收波長在270nm～280nm，綠原酸、蘆丁、p-香豆酸和阿魏酸的紫外吸收波長在300nm～350nm，各個成分吸收效果最好。本試驗選用分段掃描的方式，所選取的液相色譜柱可保證沒食子酸和沒食子兒茶素在5.110min前有保留，在5.8min將掃描波長由278nm切換到327nm，所有多酚類化合物均呈現良好的響應值。

2.3.3方法評價結果顯示，在相應的濃度范圍內，以標準溶液濃度（yg*mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線呈良好的線性關系，相關系數r為0.9959～0.9999（表4）。確定方法的檢出限為0.1～1mg：100g和定量限為0.2～2.5mg·100g，能滿足定量分析的要求。樣品加標回收試驗平均回收率74.3%～107%，相對標準偏差0.4%～8.6%，結果見表5。純化后紫皮豇豆多酚組成成分的HPLC色譜圖見圖6-b，圖6-a為同等色譜條件下6種多酚標準混合溶液的HPLC色譜圖。

2.4紫皮豇豆樣品的測定

收集10份海南產八月豆紫皮豇豆樣品，按照2.2.1正交試驗優化得到的提取方法及1.4.5純化方法得樣品待測溶液，按1.2色譜條件進行檢測分析，具體結果見表6。每個樣品重復測定3次，在所采集的樣品中6種多酚組分均有檢出，平均含量為0.462～6.479mg：100g。結果表明，在紫皮豇豆中6種多酚單組分平均含量最高的是蘆丁，其次是p-香豆酸，含量最低的是沒食子酸。

3討論與結論

本研究利用有機溶劑提取法，以八月豆為原材料，對紫皮豇豆多酚提取工藝進行研究。以單因素實驗結果來看，提取溶劑、溫度、pH和液料比等因素對多酚提取效果均有一定的影響，其中，提取溶劑對提取效果的影響最大。水是植物多酚的良好溶劑，但是提取中多酚往往與蛋白質、多糖相結合，需要斷裂氫鍵，經試驗論證丙酮和水的復合體最適合紫皮豇豆中多酚的提取。從正交試驗結果來看，最佳，工藝條件：提取溶劑為80%丙酮，提取溫度為4C，料液比m樣品（e）：V提取溶劑（mL）=l：5，pH為6為最優，用最優工藝條件測得紫皮豇豆中總多酚的含量為614mgGAE·100g。

雖然多酚提取方法的研究較多，但針對紫皮豇豆尤其是海南產八月豆中多酚的研究甚少，陸廣念等叫報道的采用75%乙醇提取的長綠豇豆總多酚含量為74.071mg：100g，低于本試驗從紫皮豇豆中提取得到的總多酚含量。分析原因可能是紫皮豇豆中除含有酯化、糖苷化的多酚類大分子化合物以及單寧類物質外叫，還含有大量的花青素等類黃酮色素類物質。此類物質在利用大孔樹脂吸附法對多酚粗提物進行分離純化時，保留在層析柱中未被洗脫出來，而低分子量多酚類化合物則是利用乙醇洗脫得到。除去溶劑后再利用HPLC對純化后的多酚類物質進行組分分析，通過對色譜條件的優化，建立了PLC法同時測定紫皮豇豆中沒食子兒茶素、綠原酸、蘆丁、沒食子酸、p-香豆酸和阿魏酸等兒茶素類、黃酮類及酚酸類多酚化合物的檢測方法，紫皮豇豆中6種多酚單體含量最高的是蘆丁為6.479±0.130mg：100g。以上研究結果表明：多酚雖然廣泛存在于植物體內，但由于植物成分的復雜性，在不同種類和品種中的含量差異較大，必須對其提取工藝進行摸索和優化，并進行綜合評價，才能夠得到比較科學、合理的數據。

參考文獻：

[1]祖艷俠，郭軍，梅燚，等.2個不同莢色豇豆品種的營養比較[J].浙江農業科學，2016，57（2）：292-293.

[2]張紅梅，許文靜，陳華濤，等.不同莢色豇豆品種花青素和營養成分含量變化分析[J].南方農業學報，2017，48（6）：1080-1085.

[3]劉佳偉，徐康，楊效登，等.豇豆種子及豆芽多酚類物質的含量及抗氧化性比較分析研究[J].齊魯工業大學學報（自然科學版），2017，31（2）：41-46.

[4]OJWANG L o， DYKES L， AWIKA J M. Ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry profiling of anthocyanins and flavonols in cowpea （Vigna unguiculata） of varying genotypes [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60 （14） ： 3735-3744.

[5]劉素娟，楊蒙蒙，黃浩，等.高效液相色譜-二極管陣列聯用同時測定果酒和果醋中10種酚類物質[J].中國調味品，2018，43（12）：151-153，163.

[6]鄧雅妮，郭時印，肖航，等.果蔬中不可萃取多酚的研究進展[J].農產品加工，2018（20）：62-65.

[7]夏婷，趙超亞，杜鵬，等.食品中多酚類化合物種類、提取方法和檢測技術研究進展[J].食品與發酵工業，2019，45（5）：231-238.

[8]薛宏坤，譚佳琪，趙月明，等.樹莓果渣總花色苷和總多酚微波萃取工藝及組分分析[J].精細化工，2018，43（12）：151-153，163.

[9]董科，冷云，何方婷，等.植物多酚及其提取方法的研究進展[J].食品工業科技，2019，40（2）：326-330.

[10]賴瑞聯，陳瑾，馮新，等.橄欖多酚類物質研究進展[J].熱帶作物學報，2018，39（12）：2532-2541.

[11]黎英，曾珍清，張薇，等.漳平水仙茶餅多酚的純化及其體外活性研究[J].熱帶作物學報，2017，38（8）：1456-1463.

[12]陸廣念，朱志雄，宋曉敏.常見蔬菜抗氧化活性與總酚含量的研究[J].食品科技，2009，34（9）：68-71.

[13]林寶妹，邱珊蓮，鄭開斌，等.嘉寶果葉片總多酚提取工藝優化及其體外降糖活性[J].福建農業學報，2019，34（5）：587-594.

[14]張東峰，陳家豪，郭靜，等.7種柑橘多酚、黃酮含量及其抗氧化活性比較研究[J].食品研究與開發，2019，40（6）：69-74.

[15]吳瓊，王明月，呂岱竹，等.紫皮豇豆多酚類物質的含量及其降糖活性研究[J].中國調味品，2019，44（10）：59-62.

[16] HAMMERSCHMIDT P A， PRATT D E. Phenolic antioxidants ofdried soybeans [J]. Journal of Food Science， 1978， 43 （2） ： 556-559.

[17] STRUMEYERDH， MALINMJ. Condensed tannins in grain sorghumisolation， fractionation and characterization [J]. Agric. Food Chem， 1975， 23： 909-914.

[18]朱葉梅，張雯，楊少杰，等.HPLC法測定茶葉中的7種多酚類化合物的含量[J].云南化工，2018，45（9）：66-68.

[19]隋華嵩，楊燕，侯英，等.紫紅豇豆色素組成及體外抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2014，35（24）：34-38

（責任編輯：吳宇琳）

吳瓊，王明月，葛會林，等.紫皮豇豆總多酚提取工藝研究及組分分析[J].福建農業學報，2020，35（6）：673-681.