緊密連接在血腦屏障中的研究進展

王明明，唐瑞天，萬群，徐麗麗，劉建雄*

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州；2.甘肅省人民醫院神經外科，甘肅 蘭州)

0 引言

BBB 是腦部重要的結構之一，對大腦起到屏障的作用，其組成較為復雜。各種因素都可對其調控，其中緊密連接更為重要。1963 年Farquhar 等首次通過電子顯微鏡發現了緊密連接(tight junctionTJ)。位于相鄰內皮細胞質膜間的TJ 可延伸至內皮細胞間隙，為細胞旁擴散創造一種代謝和物理屏障，在維持血腦屏障完整性和通透性方面發揮著重要作用。其可限制血液和大腦之間的物質運動，以維持腦內微循環的平衡。正常生理條件下，TJ 是一種大型的、具有高度動態性的復合物，由跨膜蛋白Occludin 和Claudins、細胞質蛋白(zona occluden ZO)、連接粘附分子(Junctional adhesive molecule JAM)和細胞骨架蛋白等組成[1]。TJ 是高度專門化的，具有復雜的分子結構，可以決定細胞極性。其組成蛋白復合物在細胞內外因子的嚴格調控下，不斷發生重構和變化改變它的生物特性，從而改變血腦屏障的通透性[2]。

1 緊密連接的組成

1.1 Occludin

Occludin 是第一個被鑒定的完整TJ 蛋白，具有60 kDa四聚體膜拓撲結構，其基因定位到染色體帶5q.13.1，該蛋白是一種完整的膜蛋白，其含有四個與連接蛋白相當的疏水結構域，連接蛋白是位于間隙連接處的完整膜蛋白；氨基酸序列為四個跨膜區段，兩個含有44 個氨基酸的細胞外環和兩個細胞內結構域[3]。第一個細胞外環的氨基酸序列高度濃縮，含有豐富的酪氨酸和甘氨酸殘基(約占60%)，第二個細胞外環對TJ 有特異性的調節功能，是細胞間形成TJ 的主要部位。胞質結構域和兩個細胞外環在Occludin 定位中起關鍵作用。通過對Occludin 結構的研究表明，Occludin 的NH2-末端有4 個結構域，將蛋白分為5 個獨立的結構域[4]。COOH-末端結構域由約250 個氨基酸殘基組成，位于細胞質中。帶電荷的氨基酸在COOH-末端胞質結構域中高度富集，COOH-末端融合蛋白特異性的與ZO-1、ZO-2 和許多其他外周膜蛋白的復合物相結合。當Occludin C 端截短可導致其與ZO-1 的相互作用喪失，阻止其組裝成TJ[5]。

1.2 Claudins

隨著對Occludin 功能認識的研究，另外兩個完整的TJ 蛋白被發現。Furuse[6]等發現了Claudin-1 和Claudin-2。進一步得出，Claudins 與Occludin 結構相似，Claudins 有4 個跨膜結構域和2 個細胞外環，但它們與Occludin 的序列無相似性。Claudins 家族前兩者的發現標志著TJ 研究的一個里程碑，其分子量大小約22～27 kDa，該膜蛋白家族有24 個成員，并揭示了Occludin 不是唯一位于緊密連接處的完整膜蛋白。Claudin-1 和Claudin-2 在細胞接觸部位高度集中[7]。當Occludin 與Claudin-1 共轉染時，明顯表達的蛋白在細胞接觸區域聚合成良好的鏈網。表明Occludin 的修飾可能會基于Claudins 的表達特性，或需要Claudins 才能完全插入形成的TJ 中。

大腦內皮細胞也可表達Claudin-3 和Claudin-5[8]。Claudin-5通過順式和反式同型二聚或異型二聚支持TJ 完整性，其缺失可導致BBB 破壞。Claudin-5 蛋白沿腦血管表達，提示Claudin-5與血腦屏障完整性密切相關，可作為血腦屏障功能狀態正常和紊亂的敏感指標。Claudin-5 的缺乏可直接導致血腦屏障通透性和選擇性的增加。Claudin-5 也參與TJ 的選擇性滲透和細胞極化。迄今為止可證明claudin-3 和claudin-5 在BBB TJ 中的定位[9]。

1.3 細胞質蛋白(zonaoccluden ZO)

ZO 屬于膜相關鳥苷酸激酶家族，有ZO-1、ZO-2、ZO-3三種構型，并且三者可組成ZO-1/ZO-2/ZO-3 復合體，其中ZO-1 是組成BBB 中最重要的一種[10]。ZO-1 是一種胞質膜相關的副蛋白，其相對分子質量約為220 kDa。ZO-1 包含三個結構域：PSD95、DlgA、ZO-1 同源域，一個SRC 同源性3 結構域和一個酵母鳥苷酸激酶同源域。ZO-1 是TJ 的主要銜接蛋白，一方面與Occludin 的C 端區域相互作用，對于TJ 中Occludin 的組裝和維持至關重要；另一方面與肌動蛋白細胞骨架相互作用，形成細胞與細胞骨架之間的連接點[11]。

1.4 連接粘附分子(Junctional adhesive molecule JAM)

1998 年Martin-Padura 等發現了另一個糖基化的跨膜蛋白：連接黏附分子，它屬于免疫球蛋白家族，由胞外的兩個免疫球蛋白樣區域、一個跨膜區域、胞漿區的一個C 端區域組成，可分為JAM-1、JAM-2、JAM-3 和ESAM 四種[12]。其中JAM-1 與BBB 內皮細胞之間TJ 有密切關系，JAM-1 分子量大約40kDa，由一個跨膜區域，2 個免疫球蛋白樣環狀結構形成細胞外區域[13]。JAM-1 是跨膜蛋白中介導細胞與細胞之間互相結合的一類分子，其表達可直接影響緊密連接功能[14]。有研究表明用微波輻射大鼠血腦屏障，檢測腦組織JAM-1 的表達量，結果顯示其表達量減少，表明JAM-1 有可能參與微波輻射致BBB 通透性增高的病理過程[15]。JAM 與ZO-1 共沉淀中，說明JAM 可能通過ZO-1 間接介導Occludin 向TJ募集。

1.5 細胞骨架蛋白

肌動蛋白為細胞骨架的主要成分，此蛋白是細胞中一種分子量為中等大小的重要蛋白。由375 個氨基酸殘基組成，是一個較大的、極其高度保守的基因編碼。多個肌動蛋白形成多聚體，亦稱肌動蛋白絲，稱為纖維狀肌動蛋白(fibrosactin F-actin)[16]。有學者通過缺氧的環境刺激內皮細胞的實驗中發現骨架蛋白F-actin 的結構發生了變化。結果表明缺氧導致BBB 通透性改變可能與F-actin 結構發生重排有關，而與F-actin 的表達量無關[17]。有研究表明通過氧糖剝奪預處理大鼠腦微血管內皮細胞間TJ，可誘導缺血耐受產生，降低內皮細胞的損傷，使細胞間ZO-1 和F-actin 的膜定位發生改變，最終對腦微血管內皮細胞的損傷起保護作用[18]。

肌動蛋白共沉積研究示，Occludin 以及ZO-2、ZO-3 在體外均與F-actin 直接相互作用，表明肌動蛋白在TJ 處參與了多種相互作用。然而actin-TJ 復合物相互作用更全面的表明，Occludin、ZO-2 和ZO-3 不結合F-actin 末端，可能與F-actin 細絲側結合蛋白連接[19]。在Occludin 的COOH 端細胞質域中也發現了F-actin 結合活性，而連接蛋白和F-actin之間的特定相互作用的功能還未被很好地理解。

2 緊密連接的作用

2.1 Occludin 的磷酸化與去磷酸化

Farshori 等通過誘導TJ 的開放和再封閉，研究了融合MDCK 細胞單層中Occludin 的磷酸化。TJ 通透性和蛋白激酶C-a 易位的增加與Occludin 磷酸化的可逆增加一致[20]。這說明蛋白激酶C-a 通過調節Occludin 磷酸化來調節TJ 屏障效能。Sontag[21]等人研究了蛋白磷酸酶2A (PP2A) 在TJ調控中的作用，PP2A 是重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。TJ 區PP2A 的增加導致Occludin 去磷酸化，同時降低跨上皮電阻，并阻止TJ 的發生：也提出PP2A 可能直接靶向并調控aPKC/Par-3 信號復合物，而aPKC/Par-3 信號復合物在調節TJ 組裝和屏障功能方面發揮作用。該研究中Occludin 去磷酸化表明Occludin 是上皮細胞中PP2A/aPKC 信號轉導的靶點。酪氨酸磷酸化與上皮細胞和內皮細胞TJ 通透性增加也有關。

Occludin 細胞內C 端尾部酪氨酸磷酸化水平被認為是決定其與ZO-1、ZO-2、ZO-3 等TJ 蛋白結合能力的關鍵[22]。結果表明酪氨酸磷酸化的Occludin 結合ZO-1、ZO-2、ZO-3蛋白的數量比非磷酸化的Occludin 高數倍?？烧J為氧化應激刺激的酪氨酸磷酸化可能改變TJ 復合物，結果示氧化應激誘導Occludin 和ZO-1 酪氨酸磷酸化，并通過酪氨酸激酶依賴機制將Occludin-ZO-1 復合物從TJ 和細胞骨架部分解離[23]。Occludin 和ZO-1 的酪氨酸磷酸化提示酪氨酸磷酸化可能介導TJ 對Occludin-ZO-1 復合物的破壞和重新定位，從而導致細胞旁通透性增加

2.2 Occludin 與GTPases 的關系

Occludin 功能磷酸化階段也受小GTPases 的影響。小GTPases 是一類gtp 結合蛋白，調控多種細胞內過程，包括調節TJ 通透性。該家族中有100 多個蛋白。根據結構和功能，將Ras 超家族分為五個主要的亞家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Rab。Ras 超家族的幾個成員已被證明可以調節Occludin的結構和功能。Jou[24]等研究了Ras 相關的小gtp 結合蛋白RhoA 和Rac1 在TJ 結構和功能組織中的作用。

本構型活性RhoA 和Rac1 突變體對Occludin 的分布產生了較大的破壞，這說明RhoA 和Rac1 在調節Occludin 功能中發揮作用。Ras 及其驅動的細胞內通路可能是TJ 功能的調節因子，特別是Raf1 被認為是Ras 的主要的中下游效應因子。Li 和Mrsny[25]證明Occludin 受致瘤因子Raf1 下調，與TJ 完整性的缺失有關。

當ATP 耗盡后，Occludin 中磷酸化氨基酸水平加速下降。此外，Occludin 中絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的調控與Rho GTPase 突變體的表達一致，這表明Rho 信號調控Occludin 活性。從本質上講，Rho 信號活性的提高保護了TJ 免受ATP 耗盡所帶來的有害影響[26]。Rho 的關鍵下游靶點p160 ROCK/Rho 激酶已被證實是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，與調控肌動蛋白組織有關。結果示Occludin 的磷酸化受到RhoA-p160 ROCK 依賴和獨立途徑的調控。這表明Occludin 磷酸化可能獨立于細胞骨架介導TJ 改變，而Occludin 是調控其磷酸化受體刺激信號通路的靶點[27]。

Rho 調控TJ 的另一種模式可能涉及直接修飾連接膜蛋白。當本構型活性形式的RhoA 在MDCK 細胞中過表達時，Occludin 磷酸化水平升高，表明Rho 信號可以直接影響TJ 蛋白。當Rho 受到內皮細胞中LPA 或組胺刺激時，Occludin 羧基端磷酸化增加，這被認為是調節Occludin 與連接肌動蛋白細胞骨架的相互作用，從而調節細胞旁通透性。

2.3 其他蛋白

Zuoet[28]等認為糖原合成酶激酶3 β (GSK-3 β)可能影響Claudins 的表達，Lengfeld[29]等人的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路通過增加Claudins 表達，控制BBB 的發育，增強BBB 表型，通過抑制GSK-3β 激活Wnt/β-catenin 信號通路可以增加β-catenin、Claudin-3 和ZO-1 的表達，從而減弱BBB的破壞。Taddei[30]等人報道，PI3K/Akt 活化可以限β-catenin向細胞核的易位，最終增加了Claudin-5 的表達。研究也表明，PI3K/Akt 的 激 活 可 以 通 過GSK-3β 和β-catenin 提 高Claudin-3 和Claudin-5 的表達。

ZO 是沿細胞膜連續分布的細胞間TJ 復合物的重要結構蛋白，與Occludin 和Claudins 相互作用，將TJ 錨定在內皮細胞骨架和肌動蛋白上[31]。ZO-1 不是特異性的TJ 標志物，但是TJ 的重要調控因子，在維持細胞極性、細胞骨架形成、TJ 定位、細胞旁屏障等方面發揮重要作用，ZO-1 與BBB滲透率也密切相關。ZO 蛋白對于緊密連接處的Claudins 和Occludin 的組裝至關重要，從而將它們錨定在肌動蛋白細胞骨架上。JAM 具有細胞與細胞間的粘附作用，也參與TJ 滲透性的調控和調節白細胞的遷移。肌動蛋白細胞骨架的調控及其與TJ 組分的相互作用在上皮屏障特性的調控中起著重要的錨定作用。提供了連接的穩定性，以及在連接重塑和細胞形狀變化過程中起到傳遞力的連接器。

3 展望

BBB 具有重要的屏障功能，對維持中樞系統的內環境起到非常關鍵的作用，而TJ 的開放與關閉調控著BBB 的功能。目前人們對緊密連接的組成，結構以及功能的認識還不夠充足。今后隨著人們對血腦屏障研究的不斷認識，對TJ 各種組成以及功能的不斷了解，認識到BBB 的變化以及TJ 組成的異常都會出現各種疾病。雖然各種成像技術，分子生物學技術相對比較成熟，但是對TJ 蛋白之間互相協調、互相影響機制的認識仍不足。在以后通過多學科合作，各種先進技術的不斷發展，人們對新知識的不斷探索，會對BBB-TJ 更有深刻的認識，提前做到對疾病的預防，以及新藥物更能容易透過BBB，對治療疾病找到最新的、可靠的作用靶點。