毛果楊WRKY基因家族鑒定與表達分析

孫晶琦 許煒清 孫晨 許曉倩 陳晶晶 王曉立

摘 要：WRKY轉錄因子是植物中最大的轉錄調控家族之一，是調控植物許多生物過程信號網絡的組成部分，具有多種生物學功能。該研究根據已公布的擬南芥基因組中當前確定的WRKY基因家族成員，利用其序列進行結構域的分析，從而確定WRKY基因家族的基本特征，并以此為基礎，從毛果楊序列庫中篩選出WRKY基因家族的成員。再利用MEGA5軟件、在線工具ExpasyProtparma、BioEdit等進行理化性質分析、motif結構對比、進化樹構建、基因表達分析等。結果表明：毛果楊WRKY基因家族20個成員編碼序列長為189～624bp，有多個染色體定位重復分布于第1、5、14號染色體上。WRKY蛋白均定位于細胞外，親水性較差，具有較高的脂溶性和不穩定性。20個WRKY基因均在毛果楊中表達，但有明顯的差異。

關鍵詞：毛果楊;WRKY蛋白;基因家族;生物信息

中圖分類號 Q943.2文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）09-0016-04

Abstract： WRKY transcription factors， one of the largest transcriptional regulatory families in plants， are part of the signal networks that regulate many biological processes in plants， and have a variety of biological functions. In this study， the WRKY gene family members were identified in Arabidopsis thaliana on the published Arabidopsis genome， and the basic characteristics of the WRKY gene family were determined by using their sequences for domain analysis. On this basis， the members of the WRKY gene family were screened out from the sequence library of Populustrichocarpa. MEGA5 software， online tools such as ExPASyProtparma and Bioedit were used to analyze physical and chemical properties， motif structure comparison， evolutionary tree construction and gene expression analysis. The results showed that the coding sequence length of 20 members of the WRKY gene family was 189～624bp， and multiple chromosomes were located and repeated on chromosomes 1， 5 and 14. All WRKY proteins were extracellular， with poor hydrophilicity and high lipid solubility and instability. All the 20 WRKY genes were expressed in Populustrichocarpa， but there were significant differences.

Key words： Populustrichocarpa; WRKY proteins; Gene family; Biological information

轉錄調控是生物在生長發育及代謝過程中調控細胞或組織中基因表達的重要機制[1]。轉錄因子（Transcription factors，TFs）是一類錨定在目標基因啟動子區域特異序列上的蛋白質，能對下游目標基因的轉錄進行促進或抑制作用，對生物體的正常生長發育和應對外界脅迫過程都具有重要的作用[1，2]。WRKY基因家族是近年來發現的一類植物特有的轉錄調節因子，它是一種植物特有的調控因子，已從多種植物中分離，如甜土豆[3]、野燕麥[4]、皺葉歐芹[5]、擬南芥[6]、煙草[7]等。根據目前所有的研究資料來看，WRKY蛋白在植物的各項生理活動過程中發揮著重要的調控作用，如胚胎形態的發生[8]、葉片的衰老等[9]，同時在非生物脅迫包括寒冷、干旱、鹽堿等[10]和生物脅迫包括細菌、真菌、病毒等[11]逆境響應及信號轉導過程中也起著重要的調控作用。

目前，對毛果楊（Populustrichocarpa）WRKY基因家族研究尚不深入。本研究通過各種途對選中的20個毛果楊WRKY基因進行理化性質分析、motif結構比對、進化樹構建、基因表達分析等，為今后更深入的研究奠定基礎。

1 數據來源與分析方法

1.1 數據來源 以毛果楊、擬南芥為實驗材料。毛果楊（Populustrichocarpa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）WRKY家族成員的基因序列信息均在美國生物技術信息中心即NCBI進行的下載。

1.2 分析方法

1.2.1 毛果楊中WRKY基因的確認與分類 根據已公布的擬南芥基因組中當前確定的WRKY基因家族成員，利用其序列進行結構域的分析，從而確定WRKY基因家族的基本特征，以此為基礎，從毛果楊序列庫中篩選出WRKY基因家族的成員。

1.2.2 序列比對和進化樹分析 利用MEGA5軟件，對毛果楊的20個WRKY基因進行氨基酸序列比對，分析它們的同源性。毛果楊的20個WRKY基因和擬南芥（Arabidopsis thaliana）WRKY家族的5個成員進行系統進化樹構建，將bootstrap值設置為1200次，根據不同的需求選擇不同的進化樹格式。

1.2.3 WRKY蛋白的理化性質分析 毛果楊WRKY蛋白相關基因的DNA長度、基因序列長度、CDS序列以及外顯子數量均從Phytozome的毛果楊數據庫中獲得。毛果楊WRKY蛋白的氨基酸數量、分子量、脂溶性、親水性和穩定性均通過在線工具ExpasyProtparma進行研究分析。對WRKY蛋白的亞細胞定位使用Plant-mPLoc進行在線預測。

1.2.4 基因組織表達分析 在Affy網站（http：//www.affymetrix.com /estore/index.jsp）檢索毛果楊WRKY基因家族成員的探針集，然后通過BAR數據庫（http：//bar.utoronto.ca /welcome.htm）分析并在線繪制熱圖，研究其在不同組織中的表達模式以及相對表達量。

2 結果與分析

2.1 毛果楊WRKY基因家族的結構 通過分析，到最后選用20個毛果楊WRKY基因家族成員（見表1）。WRKY基因的序列長度差異較大。其中POPTR_0014s08640g只有570bp，而POPTR_0014s15320g有1875bp。除POPTR_0014s08640g和POPTR_0006s13550g基因外，外顯均為3-7個。從上面的數據分析可以看出，不同的基因有著不同的結構形式，造成了它們可以用不同的方式發揮不同的作用。

2.2 毛果楊WRKY基因序列的同源性 利用MEGA5軟件，對20個毛果楊WRKY蛋白家族的氨基酸序列進行在線分析（見圖1）。標注標星號序列的同源性較高（515D-592H），表現出高的保守性。

2.3 毛果楊WRKY基因的理化性質 對毛果楊WRKY蛋白的理化性質以及亞細胞定位進行了預測分析（見表2）。由表2可知，所有WRKY家族成員的氨基酸序列均較長，含189～624個氨基酸。WRKY蛋白的等電點（PI）為5.56～9.86，說明WRKY蛋白帶正電荷。WRKY蛋白的親水性為-0.1015～-0.486，表現為親水性低。所有WRKY家族成員的穩定性指數均大于40，表現為不穩定。WRKY蛋白的脂溶指數（Aliphatic index）較高，為47.51～74.23。預測大部分WRKY蛋白定位于細胞外，這與其行使功能的位置保持一致。

2.4 進化樹的構建及分析 對擬南芥5個基因和毛果楊20個基因構建了系統進化樹。如圖2所示，這部分基因組成的進化樹可分為以下4類：A類支持率較高，由擬南芥4個基因和毛果楊17個基因組成;剩下3類支持率較低，即B類由毛果楊1個基因組成、C類由擬南芥1個基因組成、D類由毛果楊2個基因組成。由此可見，WRKY基因家族的親緣關系遠近表現出相當高的保守性，且在進化中扮演著相當重要的角色。A類中POPTR_0002s18770g和POPTR_0014s15320具有較高的重復性，且親緣關系緊密地聯系在一起。

2.5 毛果楊WRKY基因的表達模式 為了進一步地深入剖析WRKY基因家族在毛果楊植物體中轉錄水平的高低，在其根、幼葉、成葉、雌蕊、雄蕊、木質部6個不同組織以及光生苗中進行了分析并繪制成圖（圖3）。從圖3可以看出，20個WRKY基因在成葉中的表達量最低，在其他5個組織及光生苗中均有較高的表達水平。其中，POPTR_0001s00350g在營養器官中的表達量均呈現較低水平。幾乎所有的家族成員都存在著差異表達，而且大多數基因在根部和雌、雄蕊處有較高的表達量。值得關注的是，POPTR_0005s08860g、POPTR_0001s37260g在木質部中的表達較高，而在其他組織中表達量低，這意味POPTR_0005s08860g、POPTR_0001s37260g可能以某種方式參與毛果楊木質部形成的分子調控過程中。而POPTR_0012s01380g主要在雌、雄蕊中表達，其可能參與雌、雄蕊的發育過程。

3 討論與結論

3.1 討論 基因是控制生物性狀的基本遺傳單位[12]?；蚴莻€體生命活動以及發揮功能作用的基礎，在它里面儲存著大量的關于個體生長發育的一系列過程的信息數據。WRKY基因存在于毛果楊染色體的不同位點上，具有不同的基因形式。WRKY轉錄因子具有非常顯著的結構特點，其蛋白結構基本含有1～2個WRKY結構域，為DNA結合域（DBD），約由60個高度保守的氨基酸殘基組成，包括位于N端的七肽和位于C端的鋅指結構。位于N末端的七肽WRKYGQK絕對保守，是核心序列，位于C端的序列由C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型鋅指結構組成[13-15]。WRKY蛋白普遍存在于高等植物中，在擬南芥的74個成員中，絕大多數的生物學功能還未弄清楚[16]。WRKY轉錄因子可通過WRKY結構域與靶基因啟動子區的順式作用元件TTGAC（C/T）核苷酸序列（W-box）特異性結合，以此激活或抑制轉錄，進而調控下游基因的表達。有報道擬南芥WRKY4結構域由1個四鏈β片層組成，在β片層的C端由保守的半胱氨酸/組氨酸（Cys/His）殘基形成1個鋅結合袋，WRKYGQK殘基對應于序列的N端鏈，在序列的中間被Gly殘基扭折，使得涉及Trp（色氨酸）殘基的廣泛疏水作用，進而促使β鏈的結構具有穩定性。β鏈的WRKYGQK基序可以接觸1個大約6bp區域，這在很大程度上與W-box（TTGACY）的長度是一致的。表明WRKYGQK的基序可以與靶基因啟動子區的W-box結構特異性結合。除WRKY結構域之外，WRKY轉錄因子還包含其他結構域，包括TIR-NBS-LRR（Toll/interleukin-1receptor-nucleotidebindingsite-leucine-richrepeat）、激酶結構域、脯氨酸富集區、谷氨酰胺富集區、絲氨酸-蘇氨酸富集區、亮氨酸拉鏈、核定位結構域等。擬南芥AtWRKY7同時含有1個WRKY結構域和1個鈣調蛋白CaM結合結構域。WRKY轉錄因子多樣的結構域表明，擁有特殊結構的WRKY轉錄因子可以在基因表達調控中發揮重要的特殊功能作用。

3.2 結論 本研究獲得了WRKY基因家族的結構特征，20個基因家族成員主要分布在12條染色體上。毛果楊WRKY基因家族20個成員編碼序列長為189～624bp，有多個染色體定位重復分布于第1、5、14號染色體上。WRKY蛋白均定位于細胞外，親水性較差，具有較高的脂溶性和不穩定性。20個WRKY基因均在毛果楊中表達，但有明顯差異。從基因家族成員結構來看，毛果楊20個WRKY基因中大多數含有3個及以上的內含子，說明不同的基因有著不同的結構形式，從而它們可以用不同的方式發揮不同的作用。從毛果楊WRKY基因家族的熱圖來看：毛果楊WRKY基因在成葉中的轉錄水平最低，而在根、幼葉、雌蕊、雄蕊、木質部其他5個組織及光生苗中均具有較高的轉錄水平。從理化性質分析結果來看：毛果楊WRKY基因多數定位在細胞外，其不穩定指數較高，脂溶性指數較低，親水性較低。

本研究利用多種計算機軟件工具，對毛果楊WRKY基因家族進行了生物信息學的分析，對其家族成員進行了鑒定，為今后研究該類基因的功能提供了信息依據。另外，本研究對毛果楊WRKY基因家族的研究還只停留在對其基因序列等的簡要分析，而要想真正了解它的相關作用，還需要在未來對各個領域進行更深入的研究。

參考文獻

[1]Zhang YJ，WangLJ.The WRKY transcription factor superfamily：its origin in eukaryotes and expansion in plants[J]. BMC Evol Biol.，2005，5（1）：1.

[2]Martinez E. Multi-protein complexes in eukaryotic genetranscription[J]. PlantMolBiol，2002，50（6）：925-947.

[3]lshiguro S，Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein，SPF1，that recognizes SP8 sequences in the 5′ upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato[J]. Mol Gen Genet.，1994，244：563-571.

[4]Rushton PJ，MacDonald H，Huttly AK，et al. Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of alpha-Amy2 genes[J].Plant MolBiol.1995，29：691-702.

[5]ushton PJ，Torres JT，Parniske M，et al. Interaction of elicitorinduced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes[J]. EMBO J，1996，15：5690-5700.

[6]de Pater S，Greco V，Pham K，et al. Characterization of a zincdependent transcriptional activator from Arabidopsis[J]. Nucleic Acids Res.，1996，24：4624-4631.

[7]Chen CH，ChenZX.Isolation and characterization of two pathogen-and salicylic acid-induced genes encoding WRKT DNA-binding proteins from tobacco[J].Plant Mol Biol.，2000，42（2）：387-396.

[8]Lagace，M，Matton，et al. Characterization of a WRKY transcription factor expressed in late torpedo-stage embryos of Solanumchacoense[J]. PLANTA，2004，219（1）：185-189.

[9]RobatzekS，Somssich IE. Targets of ArWRKY6 regulation during plant senescence and pathogen defense[J]. Genes Dev.，2002，16（9）：1139-1149.

[10]Fu QT，Yu DQ. Expression profiles of AtWRKY25.AtW（_RKY26and AtWRKY33under abioticstresses[J].Hereditas（Beijing），2010，32（8）：848-856.

[11]EulgemT，RushtonPJ，RobatzekS，et al The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends Plant Sci.，2000，5（5）：199-206.

[12]龐文玉，王安，楊寶誼，等.大白菜ENT基因家族的鑒定與生物信息學分析[J].江蘇農業科學，2019，47（12）：52-57.

[13]EulgemT，RushtonPJ，RobatzekS，et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends in Plant Science，2000，5（5）：199-206.

[14]Rushton PJ，SomssichIE，RinglerP，et al.WRKY transcription factor[J]. Trends in Plant Science，2010，15（5）：247-258.

[15]MaeoK，HayashiS，KojimaSH，et al.Role of conserved residues of the WRKY domain in the DNA-binding of tobacco WRKY family proteins[J]. Bioscience Biotechnology，2001，65（11）：2428-2436.

[16]Dong J，Chen C，Chen Z. Expression profiles of the Arabidopsis wrky gene superfamily during plant defense response[J].Plant MolBiol.，2003，51：21-37.

（責編：張宏民）