腦原位成像的小分子熒光探針研究進展

周 穎， 諶委菊， 李俊彬

（長沙理工大學化學化工學院， 細胞化學湖南省重點實驗室， 湖南長沙410114）

0 前言

大腦是人體最重要和最復雜的器官，嚴格控制著身體的其他器官[1-2]。 與此同時，任何輕微的疾病和損傷都可能導致大腦功能產生障礙，從而引發各種腦部疾病，如阿爾茲海默癥、癲癇、抑郁癥及腦缺血等[3-4]。 目前，中樞神經系統相關疾病占全球疾病負擔的6．3%， 不僅給患者帶來了難以忍受的痛苦和折磨，同時也給患者家屬帶來了巨大的壓力。 隨著人口老齡化的嚴重，這一數據仍在不斷增加[5]。 研究表明，腦部疾病的發生和發展過程與活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、活性硫（RSS） 以及各種蛋白等物質有著密不可分的關系。如，氧化應激所產生的ROS、RNS 可導致神經元死亡，造成不可逆的神經元功能障礙，進而引發腦部相關疾病[6-9]。 RSS 作為重要的還原調節劑，為氧化還原平衡的維持提供了重要保障[10-11]。淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊和高度磷酸化的神經原纖維纏結（NFT）是阿爾茲海默癥的兩種重要的生物標志物[12]。 此外，酶含量及活性的變化也與腦部疾病密切相關。 如腦供血不足會引起缺氧和硝基還原酶的過表達[13]；乙酰膽堿酯酶(AChE) 是神經遞質乙酰膽堿的關鍵水解酶，保證生物體內神經信號的正常傳遞，與抑郁癥等疾病相關[14]。 因此，實時、原位檢測腦內生物活性分子對于揭示腦部疾病的病理機制，預防、早期診斷及有效治療腦疾病具有重要意義。

目前， 一些腦原位成像技術已經發展起來，如計算機斷層掃描[15]、正電子發射斷層掃描[16]、磁共振成像和血管造影[17]等。 然而，上述方法難以實現活性分子的原位、實時可視化。 基于小分子探針的熒光成像因具有結構可調、 高靈敏度、高時空分辨率及操作簡便等優點，是腦內生物活性分子原位成像的首選。 然而，不同于其他器官的檢測與成像，用于原位檢測腦內活性物質的探針首先需要穿透血腦屏障。 血腦屏障（BBB）作為將中樞神經系統與血管系統分開的最嚴格調節的界面， 限制了外部物質和有毒化學物質的通過，只允許選擇的離子和必需分子通過[1,18]。 然而，血腦屏障的存在使得大約98%的小分子和幾乎所有的大分子都無法進入腦實質[1,18]，從而導致腦疾病診斷的效率并不理想。 雖然通過各種物理、 化學和生物刺激， 可瞬時增加BBB 的通透性[6]，在不改變小分子的化學結構的情況下增強其在大腦中的積累，但這種非特異性和非選擇性的方法也會導致一些有毒有害物質同時進入大腦，帶來新的病理問題。 此外，還可通過腦注射的方式將小分子探針及藥物直接注入腦實質，但這種方式有可能影響中樞神經系統的正常功能，且其準確性也有待考究。

據文獻報道， 通過嚴格的分子結構設計，可使其能被動跨細胞擴散穿過BBB。 親脂性和分子量被認為是評估小分子熒光探針穿過BBB 能力的兩個重要參數。 分子探針應具有合適的脂水分配系數（一般為2．0～5．0 之間），且其分子量一般應小于500 Da[19]，才能較好的穿透BBB。 分子氫鍵數目、分子極性表面積及靈活性等參數也可能影響其BBB 滲透能力[20-21]。 此外，因可見光的組織穿透深度較淺，為了更好的實現腦組織的原位成像，分子探針的激發和發射波長處于近紅外區域也是重點考慮的。 該文綜述了分子探針在大腦生物活性分子原位成像中的研究進展，并探討該領域面臨的挑戰與發展方向。

1 小分子熒光探針在腦原位成像中的應用

近年來，科研工作者已設計并合成了多種小分子熒光探針用于腦原位成像，其傳感機制主要涉及光誘導電子轉移[22]、分子內電荷轉移[23-24]、熒光共振能量轉移[25-27]、聚集誘導發光[28]等。 探針的分析對象主要為ROS、RNS、RSS 以及蛋白質，為相關腦疾病的病理機制研究、診斷及治療提供了有效工具。

1.1 ROS 熒光探針

研究表明，較低水平的ROS 對于維持細胞穩態和功能至關重要，而細胞中ROS 的過度產生會導致細胞功能障礙。 2017 年，冉崇昭等設計并合成了探針CRANAD-61 用于成像阿爾茲海默癥和腦淀粉樣血管病中的ROS[29]。 該探針對ROS響應快速、靈敏度高且能穿透BBB，可同時通過微觀和宏觀水平的成像監測大腦ROS 含量變化（圖1）。

圖1 用于ROS 敏感成像的探針CRANAD-61 的設計原理[29]Fig．1 Schematic of the design of probe CRANAD-61 for ROS-sensitive imaging[29]

劉志洪等報道了一種近紅外發射熒光探針Mito-NIRHV 用于粘度和H2O2的高靈敏檢測[30]。探針在近紅外區域有兩個獨立的發射，且兩者都具有＞200 nm 的斯托克斯位移。 基于探針良好的光物理特性和BBB 穿透能力， 該探針成功實現了活細胞和阿爾茲海默癥大腦中H2O2和粘度變化的成像（圖2）。

圖2 探針Mito-NIRHV 對粘度和H2O2 的響應機理及其在AD 大腦中的成像[30]Fig．2 Response mechanism of Mito-NIRHV to viscosity and H2O2 and its imaging application in AD brain[30]

2019 年，唐波等構建了一種雙光子熒光探針TCE 用于生命系統的·OH 原位成像[31]。該探針以3-甲基-吡唑啉酮的單電子氧化作為特異性識別位點，具有優異的選擇性。 通過對抑郁癥小鼠大腦中的·OH 成像，他們發現·OH 的增加與抑郁嚴重程度呈正相關。 此外，·OH 已被證明可以使去乙?；窼IRT1 失活，從而誘導抑郁癥的發生和發展（圖3）。

圖3 探針TCE 的結構和熒光響應機理[32]Fig．3 Structure and fluorescence response mechanism of TCE[32]

受喹諾酮類神經保護藥物的啟發，2020 年，錢勇等構建了一種雙光子HClO 熒光探針HCP用于對髓過氧化物酶介導的氧化應激進行成像[33]。利用該探針可在具有癲癇行為的小鼠大腦中可視化過表達的HClO。 此外，他們采用探針設計了一種高通量篩選方法來篩選潛在的抗癲癇藥物以調節髓過氧化物酶介導的氧化應激。 篩選所得的黃酮類化合物芹菜素可緩解髓過氧化物酶介導的氧化應激并抑制神經元細胞的鐵死亡（圖4）。

圖4 探針HCP 對MPO 介導產生的HClO 的響應機理及高通量篩選抗癲癇藥物的策略[32]Fig．4 Response mechanism of HCP to MPO-mediated HClO and strategy for high-throughput screening of antiepileptic drugs[32]

梁磊等基于噠嗪酮骨架開發了一種超靈敏的腦靶向熒光探針PCAB，用于腦內H2O2的成像和腦缺血再灌注損傷的快速檢測[33]。作為一種雙光子熒光探針， 該探針具有較好的BBB 穿透能力，且對H2O2表現出快速、特異性響應。 通過追蹤活體小鼠腦內H2O2的動態變化， 他們發現腦缺血再灌注損傷與H2O2誘導的不同大腦區域的自噬有關（圖5）。

圖5 探針PCAB 的結構及其在腦缺血小鼠體內對H2O2 的成像[33]Fig．5 The structure of PCAB and its imaging of H2O2 in mice with cerebral ischemia[33]

1.2 RNS 熒光探針

RNS 是一類高活性分子，在各種生理和病理過程中起著至關重要的作用。 2019 年，錢勇等曾基于亞甲基藍報道了一種近紅外熒光探針ONP用于跟蹤活細胞和體內過氧亞硝酸根離子（ONOO-）的動態變化[34]。 該探針具有高靈敏度和選擇性的優點，可用于紅藻氨酸誘導的癲癇發作的大腦中內源性ONOO-原位成像。 實驗表明ONOO-在癲癇腦中過度表達會引起神經元損傷，而采用姜黃素給藥可消除該損傷，進一步有效保護神經元細胞（圖6）。

圖6 （A）探針ONP 對ONOO-的響應機制；（B）探針ONP 在小鼠體內進行熒光成像[34]Fig．6 (A)The proposed response mechanism of ONP;(B)In vivo NIR fluorescence imaging with ONP[34]

2020 年，李新等設計開發了一種超靈敏探針B545b，用于腦中風疾病中亞硝化應激成像[35]。探針顯示出幾乎為零的背景熒光信號，與ONOO-響應后熒光增強近1000 倍。 經靜脈注入后，探針可順利穿透BBB，在腦內迅速積聚并監測局部血管損傷。 他們進一步研究了中風中亞硝基應激的病理影響（圖7）。

圖7 （A）探針B545b 的結構及其對ONOO-的響應機理；（B）探針B545b 應用于微血管堵塞的成像原理圖[35]Fig．7 (A)The structure of B545b and its response mechanism to ONOO-；(B)The imaging principle of B545b applied to microvascular occlusion[35]

1.3 RSS 熒光探針

RSS 常作為生命活動的調節劑，在損傷和氧化應激下作為抗氧化劑發揮關鍵作用。 2019 年，唐波等報道了一種用于監測Cys 的新型雙光子熒光探針TCS[36]，該探針具有優異的靈敏度和生物相容性，能實現Cys 特異性響應。 探針成功用于二硫蘇糖醇刺激的PC12 細胞中Cys 檢測。 通過構建抑郁癥小鼠模型，探針成功揭示了Cys 水平與抑郁程度呈負相關（圖8）。

圖8 探針TCS 的結構及其對Cys 的響應機理[37]Fig．8 The structure of Mito-CP and its response mechanism to Cys[37]

劉志洪等設計了一種近紅外熒光探針Mito-CP 用于跟蹤戊四唑誘導的癲癇發作大腦中的內源性Cys[37]。 探針具有良好的線粒體靶向和BBB穿透能力，不僅能實現在戊四唑刺激下PC12 細胞中Cys 的檢測， 還可以在斑馬魚中實時監測到由脂多糖誘導的氧化應激中的Cys 波動， 并成功應用于活體小鼠癲癇模型中Cys 原位成像（圖9）。

圖9 （A）Mito-CP 的結構及其對Cys 的響應機理；（B）Mito-CP 應用于小鼠中進行熒光成像[38]Fig．9 (A)The structure of Mito-CP and its response mechanism to Cys;(B)In vivo fluorescence imaging of Mito-CP[38]

王卓等基于半花菁和Si-羅丹明結構設計并合成了一種近紅外熒光探針SiR-Bs，用于精神分裂癥中H2S 的成像研究[38]。 Mindo-SiR 表現出良好的線粒體靶向性、BBB 穿透能力。 探針成功實現活細胞和小鼠大腦外源性和內源性H2S 變化，并對精神分裂癥小鼠模型腦內H2S 的變化進行原位成像，表明精神分裂癥小鼠腦內H2S 水平會異常升高（圖10）。

圖10 Mindo-SiR 的結構及其對H2S 的響應原理[38]Fig．10 Structure of Mindo-SiR and its response to H2S[38]

1.4 蛋白類熒光探針

2019 年， 崔夢超等基于多光譜熒光成像報道了一系列近紅外環境敏感型探針用于區分阿爾茲海默癥患者大腦中Aβ 斑塊和NFT[39]。 其中，探針18 與Aβ 斑塊和NFT 之間均存在強烈的相互作用， 并分別在體外和體內熒光實驗中證實了其分辨Aβ 斑塊和Tau 聚集體的能力（圖11）。

圖11 近紅外環境敏感型探針的合成路線及其在阿爾茲海默癥小鼠中的成像應用[39]Fig．11 Synthetic route of a series of near-infrared environment-sensitive probes and its imaging application in Alzheimer＇s disease[39]

唐波等報道了一種雙光子熒光探針MCYN用于實時可視化乙酰膽堿酯酶[14]。探針的氨基甲酸酯基團可被乙酰膽堿酯酶特異性識別，釋放出染料，熒光顯著增強。 采用雙光子成像，探針在抑郁癥小鼠模型中成功實現乙酰膽堿酯酶原位成像。 作者發現抑郁癥小鼠大腦中的乙酰膽堿酯酶活性明顯增加（圖12）。

圖12 MCYN 的結構及其對乙酰膽堿酯酶的響應機制[14]Fig．12 Structure of MCYN and its response mechanism to acetylcholinesterase[14]

腦供血不足會引起缺氧和硝基還原酶（NTR）過表達。 吳水珠等設計了一種近紅外NTR熒光探針TPAQS-NO2用于監測腦缺血小鼠模型中的缺氧[13]。 探針因存在光致電子轉移效應，熒光猝滅。 在NTR 的催化下，探針的硝基被還原為伯胺基團，隨后發生1,6-重排消除反應，光致電子轉移效應被阻斷，熒光增強。 探針成功用于監測小鼠腫瘤模型中早期腫瘤和晚期腫瘤的缺氧情況及腦缺血小鼠模型中的缺氧狀態（圖13）。

圖13 探針TPAQS-NO2 對腦缺血中硝基還原酶的響應機理[13]Fig．13 Response mechanism of TPAQS-NO2 to nitroreductase in cerebral ischemia[13]

朱為宏等通過引入親脂性π 共軛噻吩橋來紅移探針的發射波長并增強BBB 穿透性，構建了一種近紅外聚集誘導發光探針QM-FN-SO3[28]。探針避免了如商業硫黃素衍生物等存在的熒光自猝滅現象。探針與Aβ 斑塊具有出色的結合力，且結合后熒光顯著增強。 探針成功用于小鼠腦內Aβ 斑塊的原位成像（圖14）。

圖14 探針QM-FN-SO3 的結構及其在野生型和APP/PS1 型小鼠腦內和離體腦切片中Aβ 斑塊的熒光成像[28]Fig．14 Structure of QM-FN-SO3 and fluorescence imaging of Aβ plaques in wild-type and APP/PS1-typemouse brains and in isolated brain sections[28]

2021 年，錢勇等通過引入分子內旋轉供體基團， 構建了一種基于姜黃素的近紅外熒光探針CAQ 用于選擇性監測體內Aβ 斑塊[40]。 探針具有出色的BBB 穿透性，可在復雜生物體系中對Aβ斑塊進行選擇性近紅外熒光成像。 探針成功應用于阿爾茲海默癥小鼠模型腦內Aβ 斑塊的原位成像（圖15）。

圖15 探針CAQ 的結構及其對Aβ 斑塊的成像原理[40]Fig．15 Structure of CAQ and its imaging principle of Aβ plaques[40]

2 結論與展望

腦疾病的預防、早期診斷及有效治療對于生命健康至關重要。 近年來，科研工作者投入了大量精力來開發用于腦原位成像的可激活小分子熒光探針，為闡明相關信號通路、實現腦疾病的早期診斷及治療提供了有效工具。 盡管已取得了一定進展，但仍面臨較大的挑戰。 首先，探針在腦實質中的富集效率仍然有限，并且大部分探針無法穿透BBB；其次，大多數探針的穿透深度和分辨率仍不足，雖然采取雙光子成像解決了部分問題，但是激發光能量高，面臨創傷的挑戰；再次，用于原位腦成像的分子探針構建不僅要考慮合適的脂水分配系數， 同時也要兼顧分子量及激發、發射處于近紅外區域，難以進行通用的設計。針對以上挑戰，開發具有通用的設計思路，如篩選合適的熒光基團及合適的靶向基團構建探針，滿足大腦內更多生物活性分子的實時、原位成像需求可能是未來的發展方向之一。