均相電化學生物傳感器的應用研究

楊建梅， 王玲麗， 張 金， 趙 焱

（云南師范大學化學化工學院， 云南昆明650500）

0 前言

電化學生物傳感器由于儀器便攜、 響應快速、靈敏度高、選擇性好，因此在生命醫學、疾病診斷、食品安全及環境監測等領域發揮著重要的作用[1-2]。 然而，傳統的電化學生物傳感器通常需要將生物探針固定到電極上， 不僅固定過程耗時費力， 而且傳感體系中涉及到的反應發生在電極界面與溶液（固-液）兩相介質中，使反應的速率受到一定的限制，進而影響傳感器的檢測性能[3-4]。 均相電化學生物傳感器不需要將生物探針固定在電極表面， 避免了繁瑣耗時的固定化過程， 彌補了傳統電化學生物傳感器所存在的不足[5-6]。 系統深入的探究均相電化學生物傳感器的構建策略可以為電化學生物傳感器的進一步發展提供有力的理論支撐，從而加速均相電化學生物傳感器的發展進程。 該文簡要介紹了電化學生物傳感器的工作原理及分類，重點討論了均相及非均相電化學生物傳感器各自的特點，并分析了兩類均相電化學生物傳感器的構建策略。 旨在為均相電化學生物傳感器的構建和發展提供理論依據和支撐，從而加速均相電化學生物傳感器的研究進展。

1 電化學生物傳感器概述

1.1 電化學生物傳感器的原理

電化學生物傳感器是指用固定化的生物體成分（酶、核酸、蛋白質，抗原、抗體、激素等）或生物體本身（細胞、細胞器、組織等）生物材料作為敏感元件，電極作為轉換元件，以電流、電阻或者電位作為特征檢測信號的傳感器[7]。 電化學生物傳感器主要由生物識別元件、 信號轉換器及數據分析儀三個部分組成。其工作原理如下，首先通過被測物質與生物識別元件間特異性的相互作用完成生物識別過程；然后通過電極作為信號轉換裝置將生物識別信號轉換為可測的電化學信號，如電流、電阻、電位等；最后通過數據分析儀將信號輸出，實現對目標被測物定性或定量的分析[8]。

1.2 電化學生物傳感器的分類

根據生物識別元件的不同，可以將電化學生物傳感器分為電化學酶生物傳感器、電化學DNA生物傳感器、電化學免疫生物傳感器、電化學適體生物傳感器及電化學細胞生物傳感器等[9]； 根據信號輸出方式的不同，則可以將電化學生物傳感器分為電阻型電化學生物傳感器、電流型電化學生物傳感器、電位型電化學生物傳感器、及電容型電化學生物傳感器等[10]；此外，還可以根據傳感體系中反應發生所處介質的不同，將其分為非均相電化學生物傳感器和均相電化學生物傳感器。 該文主要從傳感體系中反應發生所處介質的不同，討論非均相和均相電化學生物傳感器各自的特點，并分析兩種傳感器常見的構建策略。

1.3 非均相電化學生物傳感器

非均相電化學生物傳感器也稱作固定化電化學生物傳感器，一般采用固體電極作為傳感界面，將生物識別元件固定到電極表面，目標生物分子通過與敏感元件間的特異性相互作用被捕獲到電極表面，使電極表面的電子傳遞系統受到影響，從而改變傳感體系中的電化學信號。 根據電化學信號的變化，實現對被測物質的定性或定量檢測。 這種傳統的非均相電化學生物傳感器通常需要先將生物識別元件固定在電極的表面，由此帶來了很多問題：（1） 為了將生物識別元件固定到電極表面，電極要經歷“清洗-打磨-修飾”等多個繁瑣的預處理過程，增加了傳感器構建的成本，耗費了大量的時間；（2）生物識別元件在電極表面固定的效率較低或是固定不穩定，不僅浪費試劑藥品，還會影響傳感器的靈敏度、穩定性及重現性；（3） 電極預處理及修飾等構建過程難免會存在一定的差異性，由此不可避免的會給檢測結果帶來相應的檢測偏差；（4） 將生物識別元件固定到電極表面不僅會產生較大的空間位阻效應，還會改變識別分子的幾何形狀，降低結構自由度，影響生物分子間的識別及結合效率，進而影響傳感器的靈敏度；（5） 傳感體系中涉及到的反應發生在溶液與電極界面（“液-固”）兩相非均相介質中， 使得反應的速率受到一定的限制，因此會影響傳感器的靈敏度。 生物傳感器的性能大都依賴于生物探針的表面固定化，因此生物探針固定化是制約電化學生物傳感器進一步發展的瓶頸。

1.4 均相電化學生物傳感器

均相電化學生物傳感器是指不需要將生物識別元件固定到電極表面，生物識別過程及傳感體系中涉及到的其它反應過程都在均相溶液中進行的免固定化的傳感器。 利用目標分析物引發信號分子擴散或者吸附在電極表面，即可實現對目標分析物的檢測。 與傳統的電化學生物傳感器相比，免生物探針固定的均相電化學生物傳感器不論在傳感器構建過程中，還是傳感器的檢測性能方面都凸顯出了獨特的優勢：（1） 避免了繁瑣的電極處理及修飾等過程，進一步簡化了電化學生物傳感器的操作步驟，降低了傳感器構建的成本；（2）無需將識別元件固定到電極表面，所有加入傳感體系內的生物分子均可以充分的參與反應，不會造成試劑藥品的浪費；（3）避免了電極預處理及修飾等構建過程的差異性，減小了檢測結果的偏差；（4） 參與反應的生物分子脫離了電極的束縛，恢復到最佳的幾何形態及自由度，可以自由的參與反應， 同時保持最佳的生物活性、生物識別及結合能力，提高了生物分子間的結合效率，進而提升了傳感器的靈敏度；（5）所有的反應在均相溶液中進行，使得參與反應的生物分子可以進行高效的碰撞， 不僅可以加快反應速率，還可以確保反應的有序進行，從而保證了傳感器的靈敏度。 近年來，基于上述這些獨特的優勢，一系列簡單、快速、靈敏的均相電化學生物傳感器相繼被報道。 均相電化學生物傳感器的發展彌補了傳統電化學生物傳感器所存在的不足，使電化學生物傳感器的應用變得更加的簡單方便。 系統深入地探究均相電化學生物傳感器的構建策略可以為電化學生物傳感器的進一步發展提供有力的理論支撐，從而加速均相電化學生物傳感器的發展進程。

1.5 非均相與均相電化學生物傳感器性能比較

表1 對非均相和均相電化學生物傳感器在核酸、蛋白質、小分子等檢測中的性能進行了比較。 從表中對比結果可以看出，非均相電化學生物傳感器構建過程中，其電極處理及修飾所需的時間通常達幾個小時以上。 然而均相電化學生物傳感器不需要生物探針在電極表面的固定，避免了長達數小時的電極處理和修飾過程。 更重要的是，均相電化學生物傳感器的檢測性能與非均相電化學生物傳感器的檢測性能相當， 甚至更優。由此可見，均相電化學生物傳感器在生物分析檢測中具有很大的優勢，相信其將會在未來電化學生物檢測中發揮重要的作用。

表1 非均相電化學生物傳感器和均相電化學生物傳感器性能比較Tab.1 Performance comparison of traditional heterogeneous electrochemical biosensors and homogeneous electrochemical biosensors

2 均相電化學生物傳感器的應用研究

在均相電化學生物傳感器中，電化學信號的產生主要通過電活性分子在電極表面的擴散或吸附兩種形式實現。 根據電活性分子與電極表面接觸方式的不同，可以將均相電化學生物傳感器分為擴散介導的均相電化學生物傳感器及親和介導的均相電化學生物傳感器兩類。 接下來將對這兩類均相電化學生物傳感器的構建策略進行分析總結。

2.1 擴散介導的均相電化學生物傳感器

擴散介導的均相電化學生物傳感器是基于不同存在形式電活性分子在電極表面擴散速率的不同而發展起來的傳感器。 電活性分子擴散到電極表面后，發生氧化還原反應，產生電化學信號，從而實現對目標物的分析檢測。 在這類傳感器中，通常采用銦錫氧化電極（ITO 電極）作為工作電極，DNA 作為生物探針。 ITO 電極表面帶有大量的負電荷，DNA 的磷酸骨架使其帶有負電荷。 因此研究者通常利用酶剪切或DNA 自組裝等途徑改變DNA 的結構，從而改變DNA 結構與ITO 電極間靜電作用力的大小， 實現對目標分子的定量分析與檢測。

2.1.1 基于酶剪切-擴散介導的均相電化學生物傳感器

酶剪切-擴散介導的均相電化學生物傳感器的構建通常采用以下的方式： 合理的設計DNA結構， 使標記有電活性物質的DNA 探針在沒有目標物時與電極間有較大的靜電排斥力，加入目標物后，引發DNA 結構的變化，使其能被酶識別剪切，形成單核苷酸片段，與電極間的排斥力減小，從而使得標記有電活性物質的核苷酸片段靠近電極表面，產生電流信號，實現對目標物的定量檢測。

香港科技大學I-Ming Hsing 教授課題組在2011 年首次提出了免固定的均相電化學生物傳感器的概念，并發展了一系列新型的免固定化的電化學生物傳感器實現了對多種生物分子的均相檢測[21-23]。 例如在2013 年，該課題組借助汞離子（Hg2+）誘導DNA 鏈的構象變化及核酸外切酶-III（Exo-III）剪切構建了免固定電化學生物傳感器，對Hg2+進行了均相電化學檢測[22]。 如圖1 所示，當沒有Hg2+存在時，標記有電活性物質亞甲基藍（MB）的DNA 鏈與ITO 電極間存在較大的排斥力，導致DNA 鏈無法靠近電極，因此產生的電化學響應信號很弱。 而向體系中加入Hg2+時，Hg2+誘導DNA 單鏈發生構型變化， 形成能被Exo-III 識別的DNA 雙鏈結構，Exo-III 酶將其剪切為單核苷酸片段，使標記有MB 的核苷酸與電極間的排斥力減小。 此時，標記有MB 的核苷酸可以靠近電極表面， 產生較大的電流響應信號?；诖?， 實現了對Hg2+快速簡單的均相檢測，檢測限達0．2 nmol/L。 該均相電化學生物傳感器無需繁雜的電極打磨和修飾等預處理過程， 十分簡單便捷， 為金屬離子的檢測提供了新的檢測平臺。

圖1 擴散介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測Hg2+的原理示意圖[22]Fig．1 Illustration of the Hg2+detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[22]

青島農業大學李峰教授課題組也在均相電化學生物傳感器方面做了大量的研究工作[24-27]。2017 年，該課題組報道了一種基于Exo-III 等溫切割循環放大的超靈敏均相電化學生物傳感器，對轉錄因子NF-κB p50 進行了檢測[28]。如圖2 所示，沒有目標物存在時，標記有亞甲基藍（MB）的發夾探針不能被Exo-III 識別剪切， 它與帶負電荷的ITO 電極間存在較大的靜電排斥力，因此無法靠近電極，只能得到一個微弱的電流信號。 而當加入目標物NF-κB p50 時， 發夾探針被Exo-III 識別切割，釋放出小尺寸且負電荷減少的單核苷酸-MB 片段，使MB 與ITO 電極間的排斥力減弱，MB 可以靠近電極， 產生放大的電流響應信號。 基于此，該傳感器實現了對轉錄因子NF-κB p50 的高靈敏檢測。 這個工作為轉錄因子的檢測提供了一個簡單、快速且成本低的分析平臺。

圖2 擴散介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測NF-κB p50 的原理示意圖[28]Fig．2 Illustration of the NF-κB p50 detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[28]

此外，還有很多科研小組也在均相電化學生物傳感器研究領域做出了貢獻。 例如南開大學的唐波教授課題組研究了一種基于核酸外切酶輔助的均相電化學生物傳感器， 對DNA 進行高靈敏檢測，檢測原理如圖3[29]。該方法為發展其他的核酸檢測方法提供了一定的理論支撐和新的途徑。 福州大學楊黃浩教授課題組提出了一種基于切刻酶輔助的均相電化學生物傳感器，對赭曲霉素A（OTA）進行高靈敏的檢測，檢測原理如圖4所示[30]。 該方法簡單，快速，具有高靈敏度，檢測下限低達0．004 ng/mL。

圖3 擴散介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測DNA 的原理示意圖[29]Fig．3 Illustration of the DNA detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[29]

圖4 擴散介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測OTA 的原理示意圖[30]Fig．4 Illustration of the OTA detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[30]

2.1.2 基于DNA 自組裝-擴散介導的均相電化學生物傳感器

除了通過酶剪切改變DNA 結構與電極間的排斥力之外， 還可以利用DNA 自組裝改變DNA結構與電極間靜電排斥力的大小，實現對目標分析物的檢測。 I-Ming Hsing 教授課題組提出了一種基于DNA 和肽核酸（PNA）自組裝構建的均相電化學生物傳感器，實現了對特定核酸序列的高靈敏檢測[23]。 如圖5 所示，當沒有目標核酸序列時，標記有二茂鐵的PNA（Fc-PNA）由于不帶電荷，因此可以自由的移動到ITO 電極表面，產生較大的電流響應信號。 而當存在目標物時，目標物引發DNA 和PNA 之間的級聯自組裝，得到樹枝狀的DNA/PNA 的納米結構，此時，由于納米結構中含有大量的DNA 序列， 使其帶有大量的負電荷， 與電極之間產生很大的排斥力， 阻礙Fc-PNA 接近電極表面，只能得到一個較小的電流響應信號。 根據電流響應信號的變化，即可對目標物進行定量檢測。 該方法構建簡單、靈敏度高，檢測限低達100 fmol/L， 為核酸的高靈敏且簡單快捷地檢測開辟了新途徑。

圖5 擴散介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測特定核酸序列的原理示意圖[23]Fig．5 Illustration of the nucleic acids detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[23]

李峰教授課題組報道了一個免標記、免固定化的均相電化學生物傳感器，對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑進行了檢測[31]。 如圖6 所示，沒有殺蟲劑存在時，乙酰膽堿酶能催化HP 探針水解，使其由發夾型結構變為單鏈結構， 單鏈DNA 引發掛鎖探針在T4 聚合酶下聚合形成雙鏈， 從而引發滾環擴增放大反應， 產生一條包含很多G-四分體結構的DNA 長鏈， 捕獲大量的亞甲基藍分子， 亞甲基藍與電極表面間的擴散速率減小，導致電流信號減弱。 當有殺蟲劑時，殺蟲劑能抑制乙酰膽堿酶的活性， 因此不能引發接下來的滾環擴增放大反應， 大量自由的亞甲基藍可以擴散到ITO 電極表面， 產生較大的電流響應信號。 根據電流信號的變化，即可對殺蟲劑進行定量檢測。 該傳感器能應用于實際樣品檢測中，為傳感器在環境及食品安全方面的監測開辟了新的途徑。

圖6 擴散介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測殺蟲劑的原理示意圖[31]Fig．6 Illustration of the pesticide detection by the diffusion mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[31]

2.2 親和介導的均相電化學生物傳感器

除擴散介導的均相電化學生物傳感器外，研究者在電極表面修飾特殊的能吸附生物分子的分子層，利用生物分子與電極表面功能化修飾的表面分子之間的π-π 堆積等非共價鍵相互作用，發展了親和介導的均相電化學生物傳感器。

據文獻報道， 石墨烯六元碳環與單鏈DNA堿基中碳環結構間的π-π 堆積相互作用使石墨烯對單鏈DNA 有著較強的親和力。 而DNA 雙螺旋結構會屏蔽核酸堿基， 因此石墨烯與DNA 雙鏈間的親和力很小。 李峰教授課題組結合石墨烯獨特的性質和電化學傳導的高靈敏性， 構建了π-π 堆積親和介導的均相電化學生物傳感平臺，對癌胚抗原（CEA）進行了檢測[32]。 如圖7 所示，通過電化學還原在玻碳電極上修飾還原氧化石墨烯得到傳感器界面 （GCE/rGO）。 沒有目標物CEA 時，體系中所有的DNA 以發夾型結構（雙鏈結構）存在，不能被吸附到電極表面。 而當加入目標物CEA 時，CEA 引發兩個發夾探針間的自組裝，使HP2 的5’末端變為能被T7Exo 酶識別的狀態，在酶的切割下，釋放出標記有亞甲基藍的DNA 單鏈。 單鏈DNA 通過與還原氧化石墨烯間的π-π 堆積相互作用吸附到GCE/rGO 電極表面，產生放大的電化學信號，實現對CEA 的高靈敏檢測。 這種基于親和介導的方式為均相電化學生物傳感器的構建提供了新的途徑，并為癌癥標志物的檢測提供了新的思路。

圖7 親和介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測CEA 的原理示意圖[32]Fig．7 Illustration of the CEA detection by the affinity mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[32]

Li Wang 教授課題組在電極表面修飾十二烷基硫醇單層膜，利用十二烷基硫醇上烷基鏈與亞甲基藍之間的疏水作用，構建了親和介導的均相電化學生物傳感器， 對目標DNA 分子進行了檢測[33]。 其工作原理如圖8 所示，將亞甲基藍標記在發夾型DNA 探針上時，由于DNA 探針較大的分子尺寸和親水骨架， 標記在發夾型DNA 探針上的亞甲基藍無法靠近電極表面。 當加入目標DNA 分子后，引發Exo III 對DNA 探針進行循環剪切，得到尺寸較小的標記有亞甲基藍的單核苷酸片段。 此時，標記有亞甲基藍的單核苷酸片段通過與十二烷基硫醇上烷基鏈間的疏水作用被吸附到電極表面，得到放大的電流信號，實現對目標DNA 分子的檢測。 這種均相電化學生物傳感器為核酸的檢測提供了新的檢測平臺，不僅簡化了實驗步驟，還有利于靈敏度的提高。

圖8 親和介導的免固定均相電化學生物傳感器檢測DNA 的原理示意圖[33]Fig．8 Illustration of the DNA detection by the affinity mediated immobilization-free homogeneous electrochemical biosensor[33]

3 總結與展望

綜上所述，均相電化學生物傳感器的構建主要通過電活性分子的擴散介導或親和介導兩種方式實現。 由于均相電化學生物傳感器的構建中， 不需要將生物識別元件固定到固體電極表面，因此避免了繁瑣耗時的固定化技術及其帶來的重現性差等問題，簡化了實驗操作流程。 此外，由于均相電化學生物傳感器中涉及到的反應發生在均相溶液中，從而提高了反應效率，確保了傳感器的檢測性能?？傮w而言，均相電化學生物傳感技術為電化學生物傳感器的進一步發展開辟了新的道路。但是，現有的均相電化學生物傳感器仍然存在一些亟待解決的問題：（1）均相電化學生物傳感器的設計思路過于復雜， 反應所需時間較長；（2）電活性信號分子過于單一，目前應用于均相電化學生物傳感器中的信號分子只局限于亞甲基藍、二茂鐵和硫瑾等，由此導致輸出的信號也比較單一， 單一信號的輸出易受環境的影響，可能會給檢測結果帶來較大的影響。 因此，均相電化學生物傳感器仍然具有很大的發展前景。