基于Au NPs@g-C3N4 及目標物循環擴增構建miRNA 光電化學生物傳感器

吳 瑩， 安思雨， 李孟潔

（重慶科技學院建筑工程學院， 重慶401331）

0 前言

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA，長度為19-23 個核苷酸的單鏈小分子，參與了許多生理和病理過程[1]。 大量研究表明，miRNA 異常表達與人類腫瘤疾病的發生與發展密切相關。 此外，miRNA 已被檢測出對各種人類疾病有響應，如傳染病、腎病和心臟病[2]。因此，miRNA 被認為是一種新的、 有效的疾病診斷標志物。 基于miRNA 具有含量低、相似性高、易降解、尺寸小等固有特征，亟需開發一種靈敏度高、穩定性好、特異性強、 易于量化miRNA 的新方法。 光電化學(PEC)傳感器是一種新興的、迅速發展起來的、光信號輸入與電信號輸出相結合的分析技術[3]。 迄今為止，由于其靈敏度高、穩定性好、特異性強等優點，PEC 傳感器已成功用于檢測各種類型的目標物， 因此構建PEC 傳感器定量檢測miRNA 是一種有前景的方法[4]。

在PEC 傳感器的構建過程中，光電材料的選擇至關重要。 類石墨氮化碳(g-C3N4)由綠色無毒、低成本元素組成，因其易加工、化學性質穩定和導電性優異，在生物傳感、電催化和光催化等領域受到了廣泛的關注[5]。此外，g-C3N4(2．7 eV)的帶隙使其具有獨特的光電性能。 然而， 基于純g-C3N4構建的PEC 傳感器因其光生電子-空穴對快速復合導致檢測靈敏度低。 為了抑制光生電子-空穴對的復合，近些年提出了多種策略，包括構造異質結、設計敏化結構、摻雜新元素和結合等離子體金屬[6]。 其中，半導體與等離子體金屬的耦合已成為抑制復合和改善光電流響應的一種常見而有效的途徑。 等離子體金屬的引入會發生表面等離子體共振(SPR)效應[7]。 具體而言，入射光的電磁場將驅動金屬粒子中電子的集體振蕩，從而增強光吸收和界面電荷轉移能力。 因此，該工作合成并采用了具有SPR 增強效應的納米金修飾的氮化碳(Au NPs＠g-C3N4)，它具有優異的光電性能，可提供優良的初始光電流信號。

該文基于Au NPs＠g-C3N4作為光電信號材料及T7 核酸外切酶參與的目標物循環擴增過程， 提出了一種高靈敏的PEC 生物傳感平臺，用于定量檢測microRNA-141(miRNA-141)。 如圖1所示， 首先將具有優良PEC 性能的Au NPs＠g-C3N4涂覆在電極表面，會產生強烈的初始光電流信號。 通過Au-N 鍵固載S1-S2 之后，將封閉劑(HT)孵育在電極表面。 隨后，加入miRNA-141 和T7 核酸外切酶， 其中miRNA-141 可以與S2 雜交，從而觸發T7 外切酶將S2 剪切成許多單鏈核苷酸， 同時釋放miRNA-141 與下一個S2 雜交。在T7 外切酶參與的目標物循環擴增的幫助下，可以將少量的miRNA-141 轉化為大量的單鏈S1。 最終，S1 和標有SiO2的S3 雜交，產生空間位阻效應，從而直接阻斷外部電子供應和光捕獲途徑。 因 此， 隨 著miRNA-141 濃 度 的 升 高，Au NPs＠g-C3N4的光電流響應逐漸被抑制， 從而可定量檢測miRNA-141 濃度。 該文所設計的PEC生物傳感平臺不僅拓寬了Au NPs＠g-C3N4在生物分析中的應用， 而且為miRNA 的靈敏檢測提供了新的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：光致電化學分析儀(荷蘭IVIUMSTAT公司)、CHI660E 電化學工作站(上海辰華儀器公司)、JSM-7800F 掃描電子顯微鏡 (SEM， 日本JEOL 公司)、三電極體系：玻碳電極(Φ=4 mm)為工作電極、鉑電極為對電極、飽和甘汞電極為參比電極。

試劑：己硫醇、凝血酶、戊二醛、四水氯金酸(HAuCl4·4H2O)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、四乙氧基硅烷(TEOS)、三聚氰胺、T7 外切酶、人體血清樣本、 NH3·H2O、NaBH4、H2O2、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]，該工作采用超純水制備溶液，用0．1 mol/L Na2HPO4、0．1 mol/L KH2PO4和0．1 mol/L KCl混合制備0．1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7．0)，相關核酸序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，序列如表1 所示：

表1 該文中相關的核酸序列Tab.1 Sequence information for the nucleic acids used in this study

1.2 Au NPs@g-C3N4 的合成

g-C3N4的合成方法與之前報道的相同[8]。 首先，在坩堝中加入5 g 三聚氰胺，并在80 ℃的大氣中干燥24 h。 接著，將中間產物轉移到馬弗爐中， 然后在550 ℃下以5 ℃/min 的升溫速度煅燒3 h。 最后，用硝酸和超純水離心去除殘留的堿性雜質。獲得的淺黃色產品(g-C3N4)儲存在冰箱中以供后續使用。

為 制 備Au NPs＠g-C3N4[9]， 混 合20 μL HAuCl4水溶液(10 mmol/L)和5 mL g-C3N4水溶液(2 mg/mL)，然后在黑暗中攪拌2 h。 接著，將新鮮制備的硼氫化鈉溶液(0．01 mol/L)逐滴加入上述溶液中并不斷攪拌。 直到氣體停止析出，反應完成。最后， 通過離心洗滌得到的Au NPs＠g-C3N4在5 mL 超純水中重新分散，以供后續使用。

1.3 SiO2 和S3-SiO2 復合材料的合成

按以前的報道所述[10]，獲得SiO2顆粒。 簡單地， 將6 mL 超純水、16．5 mL 乙醇和2 mL NH3·H2O 混合，不斷攪拌得到均質溶液。 20 min 后，加入用2 mL TEOS 分散的18．5 mL 乙醇溶液，在30℃下攪拌15 h。 二氧化硅顆粒用乙醇離心洗滌三次，然后分散在乙醇中。

根據文獻[10]，制備了用氨基修飾的SiO2顆粒(SiO2-NH2)。 將0．5 mL APTES 和30 mL 制備的SiO2顆?；旌喜×覕嚢?。 隨后，將混合物在回流下加熱至76 ℃超過24 h。 將產物(SiO2-NH2)用乙醇離心清洗數次。 最后，將SiO2-NH2分散在超純水中并在4 ℃下儲存。

為了制備S3-SiO2復合材料， 將30 μL SiO2-NH2,10 μL 0．05%戊二醛和1 mL 2 μmol/L 末端含有氨基的S3 混合并在室溫下連續攪拌2 h 以完成交聯反應[11]。 通過離心純化獲得的S3-SiO2復合物，然后再分散在1 mL 磷酸緩沖液(PBS)中以備后續使用。

1.4 PEC 生物傳感器的構建

首先，將15 μL Au NPs＠g-C3N4(2 mg/mL)涂在玻碳電極(GCE)表面，在37 ℃下干燥，得到Au NPs＠g-C3N4/GCE。 然后， 將制備的20 μL S1-S2(2 μmol/L)滴在Au NPs＠g-C3N4/GCE 表面，保存12 h，通過Au-N 鍵穩定固載。 隨后，將10 μL 己硫醇(HT，0．1 mmol/L)孵育30 min 以阻斷非特異性位點。 隨 后， 將20 μL 不同濃度的目標物(miRNA-141)和100 U/mL T7 外切酶在25 ℃下孵育90 min。 如 圖1 所 示，T7 外 切 酶 參 與 的miRNA-141 循環擴增過程將被觸發。 具體地說，miRNA-141 將取代S1 形成miRNA-141/S2 的雙鏈，該雙鏈可被T7 外切酶從5’到3’方向切割。結果，S2 被切割成單鏈核苷酸，miRNA-141 被釋放以取代下一個S1。 經過N 次循環后，大量的單鏈S1 裸露在電極表面。 最后， 將20 μL S3-SiO2復合材料涂覆在GCE 表面， 在37 ℃下孵育2 h。圖1 呈現了PEC 生物傳感平臺的構建過程。

圖1 PEC 生物傳感器的制備過程示意圖Fig．1 Schematic diagram of the PEC biosensor construction process

1.5 PEC 測量

PEC 測量是在含0．125 mol/L H2O2(電子供體)的5 mL PBS 緩沖溶液中進行。 選擇波長為460 nm 的LED 燈作為激發光源，在0．0 V 電位下關-開-關10-20-10 秒。 電化學阻抗的測量在含有5．0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-和0．1 mol/L KCl 的2 mL PBS 中。 所有測量均在室溫下進行，采用傳統的三電極體系，包括飽和甘汞電極(參比電極)、鉑絲(對電極)和玻碳電極(工作電極)。

2 結果與討論

2.1 不同材料的表征

用掃描電鏡(SEM)表征了實驗所涉及的納米材料，包括g-C3N4、Au NPs＠g-C3N4和SiO2。 如圖2A 所示， 合成的g-C3N4的形貌為二維薄霧狀結構。用Au NPs 修飾后，可以清晰地看到g-C3N4表面有許多均勻修飾的納米顆粒(圖2B)。 此外，在圖2C 中記錄了SiO2顆粒的SEM 圖像。SiO2顆粒呈大小均一的球狀結構，粒徑約為350 nm，這表明SiO2顆粒的制備是成功的。

圖2 g-C3N4(A)、Au NPs＠g-C3N4(B)和SiO2 顆粒(C)的SEM 圖像Fig．2 SEM images of g-C3N4(A),Au NPs＠g-C3N4(B)and SiO2 particles(C)

2.2 實驗條件的優化

為了獲得優異的PEC 分析性能， 對PBS 中H2O2濃度和激發波長進行了優化。如圖3A 所示，在0．02 mol/L～0．125 mol/L H2O2濃度范圍內，光電流隨其濃度的增大呈上升的趨勢。 但隨著H2O2濃度的進一步增加，光電流達到穩定。 因此，最佳的H2O2濃度為0．125 mol/L。 從圖3B 可以看出，在660 nm、623 nm、523 nm、460 nm 四種不同激發波長下，均未觀察到明顯的光電流。 在440 nm處， 觀察到的光電流為1．2 μA。 當照射波長為365 nm 時，光電流最高為4．1 μA。 因此，該PEC生物傳感器的最佳激發波長為365 nm。

圖3 檢測溶液中H2O2 濃度(A)和激發波長(B)對光電流信號的影響Fig．3 Effect of the H2O2 concentration in detection solution(A)and the irradiation wavelength(B)on the photocurrent signal

2.3 PEC 生物傳感器制備過程的PEC 表征

為了評估所制備的PEC 傳感器的可行性，圖4 比較了逐步修飾過程中的光電流。在裸GCE 下觀察到接近零的光電流(曲線a)。由于Au NPs＠g-C3N4優異的光電性能， 在GCE 表面涂覆Au NPs＠g-C3N4后，光電流信號急劇增加(曲線b)。當S1-S2(曲線c)和HT(曲線d)連續孵育在GCE 表面上時，由于電荷轉移能力較差，光電流信號逐次減小。 最終，在T7 外切酶、miRNA-141 和S3-SiO2孵育后，光電流信號顯著降低(曲線e)，這說明DNA 雜交引入的SiO2能夠阻斷電子轉移，有效猝滅Au NPs＠g-C3N4的光電流。 這些結果表明，該生物傳感器的逐步構建過程是成功的。

圖4 生物傳感器制備過程的PEC 表征:(a) 裸電極,(b)Au NPs＠g-C3N4/裸電極,(c)S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/裸電極,(d) 己硫醇/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/裸電極,(e)S3-SiO2/T7 外切酶/miRNA-141/己硫醇/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/裸電極Fig．4 PEC responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)Au NPs＠g-C3N4/GCE,(c)S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/GCE,(d)HT/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/GCE and(e)S3-SiO2/T7 Exo/miRNA-141/HT/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/GCE

2.4 PEC 生物傳感器制備過程的電化學表征

如圖5 所示，采用電化學阻抗譜(EIS)測量對PEC 生物傳感器的制備進行了表征。 EIS 測試在含有5．0 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0．1 mol/L KCl 的2 mL PBS(pH7．0,0．1 mol/L)中進行，頻率范圍為10 kHz 至0．1 Hz，交流電壓為5 mV，直流電電壓為0．22 V。裸GCE 的電荷轉移電阻(Ret)為曲線a(Ret≈20 Ω)。Au NPs＠g-C3N4修飾后的GCE 的Ret值明顯增加(Ret≈180 Ω，曲線b)，這可能是由于Au NPs＠g-C3N4阻礙了電極表面的電子轉移。當S1-S2 固定在Au NPs＠g-C3N4/GCE 上時， 由于DNA序列導電性較差，Ret繼續增加(Ret≈370 Ω，曲線c)。 不導電的HT 孵育后Ret進一步增加(Ret≈480 Ω， 曲線d)。 由于空間位阻效應的存在，在S3-SiO2、T7 外切酶和miRNA-141 孵育后，Ret顯著增加(Ret≈730 Ω，曲線e)。 這些結果表明，PEC生物傳感器的制備是成功的。

圖5 生物傳感器制備過程的EIS 表征:(a) 裸電極,(b)Au NPs＠g-C3N4/裸電極,(c)S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/裸電極,(d) 己硫醇/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/裸電極,(e)S3-SiO2/T7 外切酶/miRNA-141/己硫醇/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/裸電極Fig．5 EIS responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)Au NPs＠g-C3N4/GCE,(c)S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/GCE,(d)HT/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/GCE and(e)S3-SiO2/T7 Exo/miRNA-141/HT/S1-S2/Au NPs＠g-C3N4/GCE

2.5 PEC 生物傳感器的性能分析

為了評價所提出的PEC 生物傳感平臺的分析性能，在最佳條件下測量了一系列不同濃度的miRNA-141 光電流信號，如圖6A 所示。 結果發現， 隨著miRNA-141 濃度從1 fmol/L 增加到1 nmol/L，光電流信號急劇下降。 圖6B 為光電流信號與miRNA-141 濃度對數之間的線性響應曲線。 線性回歸方程為:I=-0．3633 lgc+1．481，相關性系數為0．9925 (其中I 和c 分別為光電流信號和miRNA-141 濃度)，檢出限為0．3 fmol/L。 同時，將該傳感器的分析性能與已有的方法進行了比較。 如表2 所示，該論文所構建的PEC 傳感器具有相對較寬的線性范圍和相對較低的檢出限。這些結果進一步表明，該文所構建的PEC 傳感器對miRNA-141 的定量檢測是可靠和靈敏的。

圖6 (A)不同miRNA-141 濃度的光電流信號，(B)光電流信號與miRNA-141 濃度對數的線性關系Fig．6 (A)Photocurrent signals with various miRNA-141 concentrations,(B)Linear relationship between the photocurrent signals and the logarithm of miRNA-141 concentration

表2 PEC 生物傳感器同其他測定miRNA 的方法對比Tab.2 The PEC biosensor compared with other miRNA analytical methods

2.6 PEC 生物傳感器的選擇性和穩定性

為了探索PEC 生物傳感器的選擇性，該實驗利用凝血酶、miRNA-21 和miRNA-155 作為干擾物。 從圖7A 中可以看出，在存在10 nmol/L 干擾物的情況下，檢測到較強的PEC 信號，與空白檢測結果相同。而當檢測樣本為0．1 nmol/L miRNA-141 時，PEC 信號明顯減弱。 結果表明，該生物傳感器對miRNA-141 檢測具有良好的選擇性。 此外，該實驗還采用0．1 nmol/L miRNA-141 孵育的PEC 生物傳感器在連續的“關-開-關”光照下進行8 個周期的監測。如圖7B 所示，PEC 信號的相對標準偏差(RSD)為2．06%，這說明該文提出的PEC 生物傳感器對miRNA-141 的檢測具有良好的穩定性。

圖7 PEC 生物傳感器的選擇性(A)及穩定性(B)Fig．7 Selectivity(A)and stability(B)of PEC biosensor

3 結論

綜上所述， 將Au NPs＠g-C3N4作為光電信號材料， 進一步結合T7 外切酶參與的目標物循環擴增過程， 提出了一種用于miRNA-141 靈敏檢測的PEC 生物傳感器。 由于g-C3N4獨特的光學和電子性質以及Au NPs 的表面等離子體共振(SPR)增強效應，合成的Au NPs＠g-C3N4可以產生較強的PEC 信號。此外，引入T7 外切酶啟動目標物循環擴增過程可以將少量的miRNA-141 轉化為大量的單鏈S1。 輸出的單鏈S1 進一步與S3-SiO2雜交，使得SiO2能有效猝滅Au NPs＠g-C3N4的初始光電流信號，導致PEC 信號降低，從而顯著提高miRNA-141 檢測的靈敏度。 該文設計的PEC 生物傳感器為Au NPs＠g-C3N4在生物分析中的應用提供了新的平臺， 并為miRNA 的靈敏檢測提供了一種有效的方法。