基于納米材料的信號放大策略作用于電致化學發光生物傳感器的研究

熊成義， 梁文斌， 劉 雄， 鄭瑩寧， 柴雅琴*,袁若*

（1. 西南大學化學化工學院， 重慶400715）

（2. 湖北大學化學化工學院， 湖北武漢430062）

（3. 湖北省生態環境監測中心站， 湖北武漢430072）

0 引言

電致化學發光(electrochemiluminescence,ECL)是集合電化學的電位可控性和化學發光的高靈敏性優點的新型分析技術，通過施加一定的電壓進行電化學反應， 在電極表面產生電生物質，然后這些物質與自身或者體系中的其他組分因電子傳遞作用而轉化成激發態，隨后從激發態回到基態的過程，并在此過程中伴隨著發光現象[1-2]。自Kuwana 等成功發掘出魯米諾的電致化學發光動力學原理及其發光機理以來，電致化學發光體系受到了更多的關注[3]。

隨著ECL 的蓬勃發展，它在生命分析領域也逐漸有了一席之地。 生命分析對于發光體的生物相容性要求很高，而傳統的ECL 體系無法滿足這一條件，因此納米材料直接作為ECL 發光體逐漸占據了研究的核心位置，以金屬量子點、碳點和金屬納米簇為其代表。這些ECL 發光體具有較高的生物相容性、合成成本低及穩定性好的優點。

1 新型電致化學發光納米材料

雖然研究者們發現了許多物質的電致化學發光現象，但是能夠應用于實際的類型并不多。其中以酰肼類化合物的代表——魯米諾（luminol），吖啶類化合物的代表光澤精(lucigenin)及金屬配合物——釕（Ru）配合物的應用較為廣泛。

量子點（quantum dots）是指三個維度的尺寸都小于材料內部電子的費米波長的納米晶粒，屬于三維尺度限域的零維納米材料。 由于在量子點內部電子在各個維度上的運動都受到限制，使得量子點內部的電子和空穴被強烈限域，準連續能帶結構變為分立能級結構， 因此可以產生熒光。相比傳統的有機熒光分子，量子點具備一些獨特的光學性質，如發射光譜可調諧、抗光漂白、寬的激發譜和窄的發射譜、 較大的斯托克斯位移、良好的生物相容性以及熒光壽命長等優點，因此近年來廣泛應用于生物、醫學成像、光學檢測等領域。量子點的ECL 現象于2002 年首次被報道，隨后， 包括CdSe 量子點[4]、 ZnS 量子點[5]、碳量子點[6]等多種類型量子點陸續被發現具有ECL 現象。 由于量子點具有優異的發光性能，良好的生物相容性，以及可重復激發的特點被認為是理想的替代聯吡啶釕的ECL 發光物質。 近年來，量子點ECL 體系成為研究的熱點領域，被廣泛應用于各類ECL 生物傳感器。自2009 年Bard 課題組發現硅量子點之后，各種金屬量子點逐漸走進研究者們的視野[7]。 Ju 等首次報道了CdTe QDs 的陽極ECL 現象[8]。 當他們把CdTe QDs 固載在氧化銦錫電極上，置于pH 值為9．3 的介質溶液中時，可以獲得強的陽極ECL 信號，并且在+1．17 V(vs．Ag/AgCl) 電位下ECL 強度值達到最大。 除此之外，Ju 等還研究了多巴胺 （DA） 在該條件下對CdTe QDs 的猝滅機制，如圖1 所示。

圖1 量子點的陽極ECL 機理（A）和多巴胺的氧化產物對它的猝滅過程（B）Fig．1 Anodic ECL Mechanism of QDs(A)and Its Quenching Procedure by Oxidation Product of DA(B)

鎘基量子點合成工藝成熟，成本低廉，是構建ECL 生物傳感器中最常用的量子點之一，鞠熀先教授研究小組將CdSe QDs 修飾到電極表面，再修飾凝集素作為糖基的識別元件， 以S2O82-為共反應試劑增強CdSe QDs ECL 信號， 構建高靈敏生物傳感器實現對細胞表面糖基化表達水平定量分析[9]。 糖基化的細胞能夠被凝集素識別而附加到電極界面，阻礙電子傳遞，引起ECL 信號降低。 具體檢測原理如圖2 所示。 鎘基量子具有較好的ECL 性能，然而，關于其生物毒性的研究表明， 鎘基量子點存在一定程度的鎘離子泄漏，造成一定的生物毒性，同時也對分析人員健康造成潛在的威脅，因此，人們開始把目光轉向無毒性重金屬的新型量子點。

圖2 ECL 細胞傳感器的構建原理圖Fig．2 Schematic representation of ECL cytosensor for monitoring cell surface carbohydrate expression

為進一步提高金屬量子點的ECL 性能，復合型的金屬量子點也相繼問世， 如CdS:Mn QDs、CdSe＠ZnS QDs[10-11]。 Zhu 課題組提出，利用刮削涂覆在電極上制備高效的鈣鈦礦型QDs 薄膜的方法， 并借此合成了具有強ECL 性能的CsPbBr3QDs[12](圖3)。

圖3 (a)CsPbBr3 QDs 的立方晶體結構示意圖；(b)CsPbBr3 QDs 的熒光和紫外吸收光譜；（c）CsPbBr3 QDs 的高清TEMFig．3 (a)The schematic cubic crystal structure of CsPbBr3 QDs．(b)Fluorescence and UV-vis absorbance spectra of CsPbBr3 QDs dispersed in hexane．The inset shows photographs of CsPbBr3 QDs under visible and UV light．(c)HRTEM image of CsPbBr3 QDs

這些半導體金屬量子點雖然在一定程度上提高了ECL 發光體的生物相容性，但是重金屬離子的生物毒性限制了它們在生命分析領域的深入應用。

二硫化鉬（MoS2）是一類具有類似石墨烯獨特二維結構的過渡金屬二硫化物半導體納米材料，具有良好的生物相容性。 采用top-down 的制備工藝，在有機溶劑中回流，可以獲得生物相容性好的，無有機配體的MoS2量子點。Zhao 等將這種MoS2量子點用作ECL 發光物質， 表現出較強的ECL 信號，并且能夠被經典的胺類共反應試劑三乙胺顯著增強，基于此MoS2量子點ECL 體系，結合滾環擴增信號放大策略構建的ECL 適體傳感器，實現內毒素（LPS）的靈敏檢測[13]。 首先，將合成的MoS2量子點富集到Pd-Au 多面體復合物表面并在電極上成膜，為傳感器提供初始ECL 信號，進一步組裝引物構建生物傳感平臺，LPS 能夠引發從引物開始的滾環擴增，產生有大量串聯的富G 堿基片段的產物嵌入hemin 形成hemin/G-四分體， 能有效地淬滅MoS2QDs/TEA 體系的ECL 信號，ECL 信號的減小值隨LPS 濃度的增加而增加。 具體過程如圖4 所示。

圖4 基于二硫化鉬量子點的生物傳感器構建原理圖(A)MoS2＠Pd-Au 的制備過程Fig．4 Schematic Illustration of the Ultrasensitive “on-off”ECL Aptasensor for LPS Detection Based on Aptamer Recognition-Driven Target-Cycling Synchronized RCA:(A)Preparation Process of MoS2＠Pd-Au

除了過渡金屬半導體量子點，常用于ECL 生物傳感器的有碳量子點(碳點，CDs)。 碳量子點是一系列直徑小于10 納米， 具有特定的發光特性的碳納米材料，其中一些具有類似石墨烯的二維平面結構的碳量子點也被稱為石墨烯量子點（GQDs）。 碳量子點繼承了碳納米材料所具備的優異的導電性、良好的生物相容性和穩定的化學性能，同時其發光強度大，獲取成本低廉，相比金屬半導體量子點具有突出的優勢[14]。 因此，碳量子點在生物成像、生物傳感器和發光器件等應用領域受到廣泛的關注[15-16]。 2008 年，Chi 小組首次報道了電解石墨產生的碳量子點的ECL 現象，促使碳量子點成為ECL 領域的一顆新星，在ECL生物傳感器的構建上受到研究者們的青睞。

Liu 等將碳量子點直接修飾到電極表面成膜，作為ECL 信號源，以修飾了hemin/G-四分體的納米金作為ECL 猝滅探針， 構建了ECL 生物傳感器檢測蛋白激酶A（PKA）[17]。 目標物蛋白激酶A 在ATP 的輔助下， 能夠將修飾在電極上的多肽底物磷酸化，在Zr4+離子存在的條件下，猝滅探針依靠磷酸與Zr4+離子的配位鍵結合到電極表面，實現ECL 信號響應。 具體過程如圖5 所示。

圖5 以GQDs 為基底構建的PKA 生物傳感器構建示意圖Fig．5 Schematic illustration of ECL assay for PKA based on double-quenching of GQDs by pDNA＠DNAzyme-AuNPs

碳量子點化學性質十分穩定，屬于較難通過電化學反應獲得激發態的一類發光物質， 因此，大多數情況下需要使用強氧化性的過硫酸鹽作為共反應試劑并施加一定的負電壓， 這對碳量子點在ECL 生物傳感器中的應用存在一定的限制作用。 Dong 等發現將電化學掃描拓展到-1．3 ～+1．4 V 的電壓范圍內， 亞硫酸鹽也能有效地增強碳量子點的ECL 信號，為碳量子點在ECL 生物傳感器中的應用開辟了一條新的途徑。 研究表明，寬的電化學掃描范圍是亞硫酸根離子 （SO32-）能夠轉化為活性中間體硫酸根自由基（SO4·-），從而使碳量子點得以產生激發態[18]。 具體機理如圖6所示。

圖6 CQD-SO32-系統的ECL 反應原理圖Fig．6 Schematic diagram for the ECL reaction mechanism of CQD-SO32-system

碳量子點是一種納米晶體，盡管具有一定有機物的特征，其碳核具有較高的結晶度，這是鑒別碳量子點的重要特征之一，也是碳量子點發光特性的結構基礎。 但是近期的研究發現，有一些有機聚合物，盡管沒有晶體特征而不能歸入碳量子點， 也具有包括ECL 在內的獨特的發光現象，被稱為聚合物點 （PFO）。 Chen 等利用H2O2對CdTe 量子點ECL 增強而對PFO 的ECL 猝滅的特點構建了比率型ECL 酶傳感器，實現有機磷農藥殘留（OPs）的靈敏檢測。如圖7 所示，以石墨烯作為載體，修飾CdTe 量子點和PFO 構成納米復合物， 在電極上成膜提供雙電位的ECL 信號，然后，繼續修飾乙酰膽堿酯酶（AChE）和膽堿氧化酶（ChOx），檢測底液中加入乙酰膽堿；當底液中沒有OPs 時，乙酰膽堿通過AChE 的作用轉化為硫代膽堿（R-SH）， 然后進一步通過ChOx 被氧化，其巰基轉化為二硫鍵并伴隨著過氧化氫的生成，此時CdTe 量子點的ECL 信號增強而PFO 的信號受H2O2猝滅； 當底液中存在OPs 時，OPs 能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性， 從而抑制H2O2的生成，CdTe 量子點的ECL 信號降低而PFO 的信號增強，通過兩種ECL 信號的比率變化，從而實現OPs 的檢測[19]。 具體過程如圖7 所示。

圖7 基于PFO 聚合物點與CdTe 量子點構建的雙響應ECL 生物酶傳感器原理圖Fig．7 Schematic Description of the Biosensor Fabrication and Response Mechanism

金屬納米簇是一類由幾個到大約一百個原子組成的一種金屬納米顆粒， 其直徑通常小于2 nm，它們的性質介于單核金屬配合物和大的金屬納米粒子之間。 對于單核配合物，它具有量子化的電子能級；大的金屬納米顆粒仍然是一個等離子體，具有連續能帶的離域電子能級；而納米簇則介于兩者之間。 由于納米簇的尺寸接近于電子的費米波長， 連續態能帶分裂成分立的能級，隨著尺寸的減小， 納米簇的成鍵能級與反鍵能級都將減小，禁帶寬度則增大。當原子數小到一定的范圍時，納米簇就能夠具備在可見光區的熒光發射。

與量子點類似，金屬納米簇同樣具有ECL 行為。 2009 年，Diez 教授首次報道了聚合物穩定的銀納米簇的ECL 現象[20]。 更加可貴的是，最常見的由金、銀、鉑、鈀等生物毒性低的元素組成的納米簇具有比一般半導體量子點更加優越的生物相容性，因此，金屬納米簇已經成為一類非常重要的ECL 探針成為研究的熱點。金納米簇是目前為止在ECL 領域研究得最多，應用最廣泛的一種貴金屬納米簇。金納米簇ECL 體系既可以是以過硫酸鹽共反應試劑的陰極發光，也可以是以叔胺（三丙胺、三乙胺等）為共反應試劑的陽極發光。其中，陽極發光由于條件相對溫和更受研究者們的關注。 Chen 等以三乙胺作為共反應試劑，將金納米簇底涂到電極表面成膜提供ECL 信號，以二茂鐵功能化的PdPt 納米立方標記二抗， 構建了夾心型ECL 生物傳感器監測ConA[21]。 二茂鐵能夠有效猝滅金納米簇的ECL 信號， 當檢測到ConA 時，猝滅探針組裝到電極表面，ECL 信號降低。 具體如圖8 所示。

圖8 PtPd NCs 和GOD＠Fc-COOH-PtPd NCs 的合成示意圖以及ECL 生物傳感器的制備原理圖Fig．8 The illustration of the synthetic process of PtPd NCs and GOD＠Fc-COOH-PtPd NCs,and the preparation of the ECL biosensor

相比金納米簇， 銀納米簇在化學穩定性，生物相容性上有所不如，但是在發光性能有一定的優勢，同時，由于銀納米簇可以在特定的DNA 模板上原位合成，因此，在ECL 生物傳感器中同樣受到青睞。Chen 等以滾環擴增產生的由大量富胞嘧啶片段串聯而成的長鏈DNA 為模板， 原位生成銀納米簇作為ECL 信號探針， 構建了超靈敏ECL 生物傳感器檢測miRNA[22]。 首先，構建了一個多功能的DNA 環形模板， 不僅作為滾環擴增的模板，是擴增產物中包含大量串聯的富胞嘧啶片段，同時控制目標物miRNA 識別，僅在目標物miRNA 存在時，滾環擴增才能啟動，在滾環擴增進行時，目標物被置換進入下一循環。 滾環擴增完成后，只需孵育AgNO3后漂洗電極，然后通過電化學還原的方式， 在DNA 上原位生成銀納米簇，產生ECL 信號。 具體過程如圖9。

圖9 目標物循環同步滾環放大結合原位電化學生成電致化學發光銀納米簇檢測MicroRNAFig．9 Schematic Illustration of(A)the Principle of Target-Cycling Synchronized RCA and in Situ Electrochemical Generation of Ag NCs,(B)Preparation of the Circular Template,and(C)ECL Mechanism of Ag NCs/S2O82--Based ECL System Copyright 2017 ACS

除了單一金屬構成的納米簇，合金納米簇由于其更好的電化學活性， 也開始進入人們的視野。 汪爾康教授課題組以牛血清白蛋白（BSA）為配體合成了金銀合金納米簇，并以其作為信號探針構建了ECL 傳感器檢測汞離子。該合金納米簇相比單獨的金納米簇和銀納米簇具有更好的ECL 性能， 但是汞離子可以通過與納米簇結合高效猝滅ECL 信號， 由此實現對汞離子的信號響應[23]。 具體如圖10 所示。

圖10 (A)Au-Ag 合金納米簇的制備；(B)Au-Ag 合金納米簇的ECL 反應機理以及ECL 傳感器對Hg2+的檢測Fig．10 (A)Preparation Process of Au-Ag Bimetallic NCs;(B)ECL Mechanisms of Au-Ag Bimetallic NCs and the Proposed ECL Sensor for Hg2+Detection

與貴金屬納米簇相比，銅納米簇則在成本方面具有一定的優勢。 Zhao 等報道了銅納米簇的ECL 現象并研究了聯氨作為共反應試劑的ECL機理，基于該ECL 體系構建了檢測多巴胺的ECL傳感器[24]。如圖11 所示，聯氨被電化學沉積到玻碳電極表面，能夠高效地增強了銅納米簇的ECL信號，多巴胺則是該體系的猝滅劑。

圖11 基于銅簇的ECL 傳感器構建示意圖Fig．11 Schematic Showing the Preparation Process of Cu NCs and the Photo and Typical HRTEM Image of the As Prepared Cu NCs(A),Sketch Diagram of the Sensing Platform for DA Detection Based on the Cu NCs/HZ ECL System(B),and Proposed ECL Enhancing Mechanism of the Cu NCs/HZ System and ECL Quenching Mechanism by DA toward the Cu NCs/HZ System(C)Copyright 2017 ACS

2 納米材料信號放大平臺

隨著粒徑的變小，納米材料表面原子與總原子數之比急劇增大，比表面積、表面原子數迅速增加，會引起性質上旳巨大變化。 表面原子的晶體場環境和結合能與內部原子不同，表面原子周圍缺少相鄰的原子，有許多懸空鍵，具有不飽和性質，易于其他原子相結合而穩定下來，因而表現出很高的化學和催化活性。 由于具有很高的比表面積和化學活性，納米材料在ECL 分析領域常被用為納米載體，富集ECL 活性物質（發光物質或其他活性分子），以提高分析方法的靈敏度。

王柯敏教授課題組利用介孔硅高比表面積及多孔特性，將ECL 發光物質聯吡啶釕吸附到生長在電極表面的介孔硅膜的孔洞中，并使用各種靶標的核酸適配體分子封閉介孔硅的孔洞，從而構建了免標記的通用ECL 適體傳感平臺[25]。 其中，介孔材料是指孔徑介于2～50 nm 的一類多孔材料，具有極高的比表面積。 介孔硅對聯吡啶釕的高效吸附，是決定ECL 傳感器高靈敏度的關鍵因素。 具體過程如圖12。

圖12 (A)Apt-Ru＠MSFs/ITO 的制備(B)傳感器的構建示意圖Fig．12 Schematic Illustration of(A)the Preparation of Apt-Ru＠MSFs/ITO and(B)Apt-Ru＠MSFs/ITO-Assisted ECL Aptasensor Platform for Target Detection．Copyright 2017 ACS

有些ECL 體系中，其發光物質不如其共反應試劑/猝滅劑容易標記或固載， 如過硫酸鹽ECL體系，可通過納米材料富集相關體系的共反應試劑/猝滅劑，提高反應試劑/猝滅劑增強/降低ECL信號的能力。 基于這樣納米復合物，可以構建信號增強（或減?。┑姆治龇椒?，同樣能夠取得較高的靈敏度。 Zhao 等將聚組氨酸（過硫酸鹽ECL 體系的共反應試劑） 修飾到納米金功能化的C60復合納米材料表面獲得的復合納米材料，表現出對過硫酸鹽ECL 體系的高效增強[26]。 利用該復合納米材料修飾電極，為信號減小型ECL 生物傳感器提供更強的ECL 初始信號，從而提高傳感器的靈敏度。 具體過程如圖13。

圖13 ECL 適體傳感器的原理圖Fig．13 The schematic diagram of the preparation of the ECL aptasensor．Copyright 2015 Elsvier

納米材料所具備的高比表面積的特性賦予其良好的吸附能力，實現ECL 發光物質或共反應試劑的大量固載， 獲得ECL 性能好的納米復合物。 另有一類納米材料則是由發光物質或共反應試劑直接構成，相比表面吸附，其固載效率更高。Wang 等將自增強聯吡啶釕衍生物制備成納米棒，并將其作為信號標簽，構建超靈敏ECL 免疫傳感器。 這類納米材料將固載活性物質的能力推向最大化，從而能夠產生更強的ECL 信號，有效地提高傳感器的靈敏度[27]。 具體過程如圖14。

圖14 (A)釕納米棒的制備；(B)ECL 免疫傳感器的制備及反應機理Fig．14 (A)Preparation of[(Ru(bpy)2(mcbpy)2+)-TAPA]NRs;(B)Fabrication of the Immunosensor and the Reacted Mechanism．Copyright 2016 ACS

以上工作表明，納米材料通過其強大的固載能力， 使大量的ECL 活性物質能夠進入傳感界面， 從而產生更靈敏的ECL 信號相應， 實現對ECL 生物傳感器的信號放大。

除了作為納米載體富集ECL 活性物質之外，有些納米材料由于其本身的光電性質， 能夠對ECL 過程產生增強或者猝滅效果。 例如，納米金（Au NPs）在紫外-可見光區域內具有較大的吸收系數和較寬的吸收范圍等優良的光學性質，可作為很多發光體的能量受體（猝滅劑）。 當Au NPs與發光體距離較近時，能夠發生ECL 共振能量轉移（E-RET）高效猝滅ECL 發光。 陳洪淵課題組將Au NPs 與ECL 發光體分別標記到富G 堿基DNA的兩端， 利用K+誘導富G 堿基DNA 序列折疊成G-四分體結構的特性， 當K+存在時，DNA 折疊成G 四分體結構，引起Au NPs 靠近被固定在電極表面的ECL 發光體，引起ECL 猝滅，從而實現對K+的響應[28]。 當Au NPs 與發光體的距離在適當的范圍時， 由于局部表面等離子共振效應（LSPR），又能夠增強某些ECL 體系的發光（圖15）。

圖15 基于CdS NCs 與AuNPs 間能量轉移的ECL 傳感器構建原理圖Fig．15 Preparation of the ECL biosensor for K+assay based on energy transfer between CdS NCs and AuNPs Copyright 2013 RSC

最近，袁若教授課題組在研究中發現，有一些特定的物質，其本身不能產生ECL 信號，也不能作為共反應試劑單獨用于增強發光試劑的ECL 信號強度，但是卻可以加速共反應試劑與發光試劑間的相互作用，幫助共反應試劑進一步增強ECL 信號，這類物質統稱為共反應促進劑。 其中，納米材料作為共反應促進劑由于可以同時兼具納米載體的功能而成為該領域的研究熱點。

Zhou 等發現TiO2納米材料可以作為共反應促進劑， 有效提高銀納米簇-溶解氧ECL 體系的發光性能，通過在TiO2納米花表面原位合成銀納米簇制備復合納米材料作為信號標簽， 構建了ECL 免疫傳感器[29]，實現β-淀粉樣蛋白（Aβ）的靈敏檢測，具體過程如圖16。該工作中，TiO2納米花不僅扮演了納米載體的角色，富集了大量的發光物質，同時，還能夠促進銀納米簇-溶解氧ECL體系的共反應作用，增強ECL 信號強度。 機理研究表明，TiO2納米材料由于表面缺陷具有出色的催化性能，通過催化溶解氧的轉化，可以生成具有強反應活性的羥基自由基（OH·），從而提高銀納米簇的激發效率，實現ECL 信號增強。

圖16 以Ag NCs-TiO2 NFs 為基礎構建的ECL 生物傳感器原理圖Fig．16 Schematic Diagrams Showing the Preparation of Ag NCs-TiO2 NFs(A),Ultrasensitive Detection of Aβ by Combining Immunoreaction-Induced DNA Nanostructure with Fc-Driven Light Switch Biodetection(B),and Possible ECL Emitting Mechanism of Ag NCs-TiO2 NFs(C)．Copyright 2017 ACS

無論是通過納米材料富集ECL 活性物質，或者參與ECL 反應過程， 都是以直接增強/猝滅ECL 體系信號強度的方式，實現信號放大，提高ECL 生物傳感器的靈敏度。 為適應傳感器小型化的發展潮流，隨著精準化學的發展，誕生了一類將生物放大策略集成到納米材料界面的新型信號放大技術。 由于有意識的控制和優化了生物分子的動力學行為，這種集成在納米材料界面的生物放大策略相比傳統的粗放的方式具有更高的效率。

磁分離技術是一種在生物分析領域常用的利用納米材料集成生物放大策略的方式。 磁分離技術往往將識別元件組裝到磁性納米顆粒表面，可以很方便地將樣品中的目標組分從干擾基質中分離出來，并實現濃縮，從而提高分析檢測的靈敏度。 Zhou 等將一抗修飾在磁珠 （Fe3O4-Au）上， 將二抗上標記量子點功能化的納米復合物（CdS-Au）， 構建了基于磁分離技術的ECL 免疫傳感器檢測甲胎蛋白（AFP）[30]。目標物AFP 通過夾心免疫反應將二抗標記物裝配到磁珠上，在磁場的作用下， 磁珠被富集到電極界面進行檢測，檢測靈敏度得到提高。 具體過程如圖17 所示。

圖17 基于磁分離技術的免疫傳奇構建示意圖Fig．17 Scheme of the preparation procedures of the immunosensor．Copyright 2012 Elsvier

催化膽堿氧化， 伴隨著過氧化氫的生成，生成的過氧化氫馬上被Pt＠AuNFs 模擬過氧化物酶催化分解產生活性中間體，從而極大地增強魯米諾的ECL 信號，實現信號放大。 通過在納米材料表面修飾各種生物酶或模擬酶，可以將酶催化信號放大集成到納米材料表面進行，酶催化原位生成的共反應試劑相比直接加入的共反應試劑具有更高的能量，反應活性更強；同時，由于ECL發光試劑也被修飾在納米材料表面，從而使活性共反應試劑與ECL 發光試劑被限定在較小的空間內，發生反應的效率更高。 Zhou 等在以ECL 試劑魯米諾作為還原劑制備的花狀的Pt＠Au 納米合金材料（Pt＠AuNFs）表面修飾固載膽堿氧化酶（ChOx），構建集成了酶催化信號放大策略的納米復合物，以此為二抗標記物制得了檢測心肌肌鈣蛋白（cTnI）的夾心型ECL 免疫傳感器[31]。在含有膽堿的電解質溶液中進行測定時，膽堿氧化酶催化膽堿氧化，伴隨著過氧化氫的生成，生成的過氧化氫馬上被Pt＠AuNFs 模擬過氧化物酶催化分解產生活性中間體，從而極大地增強魯米諾的ECL 信號，實現信號放大（如圖18 所示）。

圖18 以ECL 試劑魯米諾作為還原劑制備的花狀的Pt＠Au 納米合金材料并以該材料為基礎構建的ECL免疫傳感器的原理圖Fig．18 The schematic diagrams of(A)show the preparation of Ab2/luminol-Pt＠AuNFs/ChOx probes(Ab2 bioconjugates),(B)reveal the mechanism of the multiple signal amplification strategy and the comparative ECL signals with the target and without the target,and(C)exhibit preparation of MnO2＠MWNTs,then(I)display the structure of the luminol molecule,(II)and(III)display the SEM images of luminol-AuNFs and luminol-Pt＠AuNFs,respectively．Copyright 2014 RSC

除了酶催化信號放大策略之外，核酸信號放大策略是另一類重要的信號放大手段。 核酸信號放大策略可以將少量的目標核酸分子轉化為數萬倍的核酸分子響應， 有效提高分析靈敏度，因此，快速、靈敏、適用性好的核酸信號放大策略是構建決定ECL 生物傳感器性能的關鍵之一。傳統的ECL 生物傳感器中，核酸信號放大策略往往在電極界面執行，這種異相反應給生物大分子（核酸，蛋白等）之間的相互作用造成了很大的阻力，信號放大效率往往要打折扣。 因此，近幾年，受到傳感器微型化潮流的引導，更重要的是得益于等溫核酸信號放大技術的逐漸發展成熟，將復雜的核酸信號放大策略集成到單個納米材料表面構成DNA 納米機器成為ECL 生物傳感器領域的一個重要研究方向。Jiang 等將適體識別觸發的催化發夾組裝策略集成到具有催化活性納米材料（CoFe2O4＠Au）上，構建了DNA 納米機器，實現了黏蛋白（MUC1）的ECL 超靈敏檢測[32]。 MUC1 與適體的特異性識別使發夾型的適體被打開，從而引發兩個發夾型DNA 的自組裝， 是標記有ECL信號分子（ABEI）的ABEI-H2組裝到納米顆粒表面，最后通過DNA 雜交，該納米復合物組裝到電極表面檢測ECL信號，CoFe2O4＠Au 能夠催化H2O2生成活性OH·增強ABEI 的ECL 信號，實現DNA 自組裝和催化雙重信號放大。具體過程如圖19 所示。

圖19 (A)3-D DNA 機器的工作機理；(B)ECL 生物傳感器的構建示意圖Fig．19 (A)Assembly Process of 3-D DNA Nanomachine Signal Probe Induced by Protein-Aptamer Binding Complex;(B)Schematic Diagrams of the Construction and the Luminescence Reaction Mechanism of the Biosensor．Copyright 2017 ACS

3 納米材料用于固載ECL 發光體

為了提高ECL 發光體的發光性能，縮短電子傳輸距離一直是研究者們所致力于的事情，這就需要將ECL 發光體固載到電極表面。那么如何實現穩定高效的ECL 發光體固載就成為研究的中心點，除了少數ECL 發光體的成膜性好而可以直接滴涂在電極表面，采用納米材料作為載體固載ECL 發光體則成為了常用的手段。 目前比較常見的納米材料載體有以下幾類：納米碳材料、貴金屬納米材料、半導體納米材料。

納米碳材料是納米材料中極其重要的一類，其穩定性好， 比表面積大及來源豐富等優點，因而備受關注。 Ke 等利用介孔碳納米球的大的比表面積，借助Nafion，通過物理吸附作用實現了大量的ECL 發光體Ru(bpy)32+的固載[33]。 此外，結合貴金屬納米材料作為載體不僅能夠提高ECL發光體的固載量，還可以利用其導電性好、具有催化活性等優點來增強發光體的ECL 性能。 Hu等以N-摻雜的碳納米管（NCNTs）為載體,用乙二醇(EG)作為溶劑，加入H2PtCl6/EG 和RuCl3/EG混合均勻后加入NaOH/EG, 以微波照射的方式獲得具有電催化活性的Pt-Ru/NCNT 復合物[34]（圖20）。

圖20 固載策略的示意圖及夾心型ECL 適體傳感器的構建Fig．20 Representative illustration of design strategy and fabrication process of the sandwiched magnetic ECL aptasensor．Copyright 2018 Elsvier

貴金屬納米材料是指Au、Ag、Pt 等一類的納米級材料， 它們可以與多種基團結合， 占據了ECL 領域的半壁江山。 對魯米諾ECL 體系而言，因其酰肼結構上的氨基活性低而使它的固載成為難題。 早期，崔華老師課題組以魯米諾直接作為還原劑，采用水熱法直接還原氯金酸得到金納米粒子（AuNPs），因此魯米諾就吸附在表面形成Au＠luminol NPs，實現了對魯米諾的固載。 Qu 課題組首先以蠟燭煙灰為原料，加入硝酸回流制得熒光碳點，此碳點表面富有羧基；隨后將其固載于Ag 納米粒子表面，形成CDs＠Ag 復合物，再把復合物與PAH 包裹的石墨烯片結合而實現碳點的成功固載[35]（圖21）。

圖21 以CDs＠Ag 為信號物的ECL 傳感器的原理圖解Fig．21 Illustration of the fabrication of a label-free electrochemiluminescent cytosensor．Copyright 2013 RSC

作為魯米諾的衍生物，ABEI 上的氨基具有相對高的活性， 能夠與很多官能團發生反應，易于固載。 Shu 等合成了5,10,15,20-四(4- 羧基苯基)-卟啉(TCPP)修飾的二氧化鈦納米顆粒（TiO2nanoparticles），該納米粒子表面帶有羧基，可以與ABEI 在交聯劑的作用下發生反應，結合在一起，實現了對ABEI 的固載[36]（圖22）。

圖22 (a)TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores 的制備過程；（b）TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores 的透射電鏡圖；（c）紫外-可見吸收光譜圖Fig．22 (a)Schematic illustration for fabrication of TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores．(b)TEM image of TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores．(c)UV-vis absorption spectra of TiO2 nanoparticles,ABEI,TCPP,TiO2-TCPP nanocomposites,and TiO2-TCPP-ABEI nanoluminophores．Copyright 2017 ACS

4 納米材料用以界面修飾

因電極的表面積有限，為提高ECL 發光體在電極上的固載量，研究者們常常會在電極界面修飾具有大比表面積、導電性能好的納米材料。

片層碳材料具有成膜性好的優勢，經常用于界面修飾。 但單純的碳材料對ECL 的貢獻不大，因此與其他納米材料的結合，尤其是一些對ECL體系有一定催化作用的納米材料就格外受青睞。Chen 等在片層的碳氮化合物(CNNS)表面修飾金納米離子，形成CNNS＠AuNPs 復合物，然后將該復合物用于界面修飾，可以增強催化性能，為后續修飾提供基石[37]。 Rashidiani 等先合成了Si-Au NPs，再將其與表面巰基包裹的GO 結合在一起，形成tGO-Si-Au NPs 復合物，最后把它滴涂在電極界面上，起到固載第一抗體和促進luminol ECL體系的作用[38（圖23、24）。

圖23 夾心型CNNS ECL 生物傳感器的組裝過程示意圖Fig．23 Procedures of assembling the sandwiched CNNS ECL biosensor and the control for evaluating the Dam MTase activity．Copyright 2018 ACS

圖24 制備的免疫傳感器的組裝過程示意圖Fig．24 Schematic illustration of proposed immunosensor in approaches 1 and 2．Copyright 2018 Elsvier

納米線結構的納米材料是另外一種重要的界面修飾材料。 Wang 等將半胱氨酸溶液加入到新制的硝酸銀溶液中， 通過適當升溫合成了銀-半胱氨酸納米線(AgCys NWs)，然后把AgCys NWs用于固載一抗[39]。 除了單金屬納米線以外，雙金屬合金納米線也是界面修飾載體之一。 Fu 等在N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入氯鉑酸、氯金酸和氫氧化鈉溶液， 通過高壓反應釜合成了金-鉑納米線Au-Pt NWs。 然后將其與半胱氨酸及hemin修飾的還原石墨烯復合物（rGO-H-Cys）反應后的復合物作為界面修飾的納米材料[40]（圖25、26）。

圖25 (A)二抗耦合物制備圖解;（B）ECL 信號增強機制；（c）AgCys Nanowires 制備Fig．25 Schematic Illustration of(A)Synthesis Process of Ab2-GOD＠Ce:ZONFs-Lum Signal Probe;(B)Possible ECL Mechanism of Signal Generation and Enhancement;(C)Preparation Process of the AgCys Nanowires．Copyright 2016 ACS

圖26 (A)界面修飾材料制備過程示意圖;（B）檢測D-Ala 的ECL 傳感器組裝過程圖Fig．26 (A)The preparation process for the rGO-H-Cys composite．(B)Schematic of the stepwise fabrication of the biosensor for ECL detection of D-Ala．Copyright 2018 RSC

5 結論與展望

標志物電化學傳感是多學科交叉和發展的產物，它融匯了生命科學、分析化學、納米技術等多個領域的特點，具有成本低廉、靈敏度高、響應速度快、易于微型化等優點，在疾病標志物的分析檢測中發揮著重要作用。 近年來多種生物技術以及納米材料相繼興起并飛速發展，國內外研究人員構建了系列的電化學生物傳感器，為其在各方面的應用提供了前所未有的機遇。 同時，21 世紀是生物經濟時代，作為生物技術支撐之一的生物傳感器迎來了新的發展機遇。 隨著材料、電子信息與生物科學等領域不斷進步， 分析化學家、生物學家、工程師和醫療專業人員之間的密切合作必將為電化學傳感進一步發展提供更廣闊的空間。