雙藤痹痛凝膠對CIA大鼠外周血調節性T細胞的作用研究

嚴國鴻　江川　潘旭東

【摘 要】 目的：分析雙藤痹痛凝膠對膠原免疫性關節炎大鼠外周CD+4CD+25FoxP3+Treg 細胞的調節作用。方法：Wistar大鼠50只，隨機分成5組，分別為正常組、模型組、雙藤痹痛凝膠高劑量組、中劑量組、低劑量組，膠原蛋白誘導大鼠關節炎，并采用流式細胞術檢測大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg及酶聯免疫吸附試驗檢測血清中IL-6表達水平。結果：與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周血CD+4CD+25 T細胞及CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞水平顯著升高，且高、中劑量組血清IL-6水平顯著下降。結論：雙藤痹痛凝膠治療類風濕性關節炎可能通過上調外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞表達水平，降低血清IL-6水平，從而恢復免疫耐受作用。

【關鍵詞】 雙藤痹痛凝膠劑；類風濕性關節炎；調節性T細胞

【中圖分類號】R2855 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）23-0033-03

類風濕性關節炎（Rheumatoid arthritis，RA），是一種慢性全身性自身免疫性疾病，屬于中醫學“痹證”范疇，臨床常出現關節疼痛，腫脹，僵直，變形等癥狀，病情反復，嚴重影響患者的生活質量[1]。雙藤痹痛凝膠為我院院內制劑雙藤痹痛酊（批準文號： 閩藥制 Z20110008） 的基礎上研制而成的新型制劑，凝膠劑是一種以水溶性高分子化合物或親水性物質為基質，與中藥或中藥提取物混合后，涂布于布上制成的外用貼劑，具有透氣性好、載藥量大、耐汗性強，可反復黏貼，不污染衣物，藥物無致敏、無刺激性等副作用。前期臨床及動物實驗證實其具有抑制 CIA 模型大鼠足趾腫脹和關節組織病理學改變，降低其關節炎指數的作用[2]。近年的研究發現調節性T細胞的功能與數量對RA等自身免疫系統疾病的發生、發展具有重要的影響，特別是對CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞的影響，它可能成為治療類風濕性關節炎的新策略和途徑，因此，本文旨在探討雙藤痹痛凝膠是否通過調節CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞，而發揮抗RA的作用。

1 材料與儀器

11 動物 Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF級，體重（220±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2007-0005，均由福建中醫藥大學動物實驗中心提供，動物適應性喂養1 周后開始試驗。

12 藥物與試劑 藥物 雙藤痹痛凝膠，由福建中醫藥大學藥學院提供，每片（8cm×12cm） 含雷公藤甲素24659μg，含青藤堿15589mg；空白凝膠膏劑，由福建中醫藥大學藥學院提供。試劑弗氏完全佐劑（chondrex公司，批號：7002），Ⅱ型膠原（chondrex公司，批號：2002-2）；APC-抗CD4 mAb（批號：551980）、PE-FoxP3 mAb（批號：560046）、IL-6酶聯免疫吸附試驗試劑盒（批號：F1567）均購于Bioscience公司，FITC-抗CD25 mAb（批號：553071）購于Biolegend公司，紅細胞裂解液購自美國BD公司。

13 儀器 CS-1EAS型電子天平（北京市菲姆斯科技開發公司，精度01g）；TGL-16G臺式離心機（上海儀分科學儀器有限公司）；InfiniteM200 Pro多功能酶標儀（TECAN）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

2 方法

21 大鼠CIA模型的建立[3-4] 取50只Wistar大鼠，隨機分成五組，每組10只，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供貼藥。將弗氏完全佐劑（FAC）與2mg/mL的Ⅱ型膠原乳液等體積混合，制成1mg/ml的膠原乳劑，除正常組外，按每只大鼠02mL乳劑（含CⅡ02mg）于尾根部皮下注射造模。7d后強化1次，除正常組外，按每只大鼠01mL乳劑（含CⅡ01mg）于尾根部皮內注射造模。

22 實驗分組及給藥 除正常組外，其余各組（模型組、雙藤痹痛凝膠膏劑高、中、低劑量組）動物初次免疫后次日起開始給藥，將藥物貼于大鼠背部后，并用醫用膠布固定；每日給藥1次，連續28d。其中模型組為空白凝膠膏劑，大小為2cm×3cm；高、中、低劑量給藥組分別給于大小為1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的雙藤痹痛凝膠膏劑。

23 流式細胞術檢測外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg 摘眼球取血，肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有05μLCD4-FITC和25μL CD25-APC單克隆抗體的離心管中，室溫避光孵育30min；加入1mL紅細胞溶解液混勻，以1500r/min離心5min，棄其上清液；加入1mL透化緩沖液（1×），以1500r/min離心5min，以試管底部不見紅色為度；棄其上清液，加固定/透化工作液500μL震勻，4℃下避光孵育12h（或過夜）。加流式染色緩沖液以1500r/min離心5min，清洗，于上述細胞懸液，加入含有1μL FoxP3-PE單克隆抗體（設IgG2α為同型對照）震勻，室溫避光孵育30min，加流式染色緩沖液清洗，加01moL/L PBS調定至300μL，上流式細胞儀檢測。

24 酶聯免疫法檢測血清IL-6表達水平 眼眶采血，1500rpm/min離心15min制備血清，待測上清液、標準品、檢測抗體使用量均為100μL，參照試劑盒的說明書檢測血清中IL-6的含量。

25 統計學分析 實驗中的檢測結果均以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<005表示差異具有統計學意義。

3 結果

31 外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞水平 采用三色熒光法標記進行流式細胞術檢測發現，與正常組比較，模型組大鼠外周血CD+4CD+25T細胞水平顯著下降，CD+4CD+25T細胞中FoxP3+T表達明顯下降（P<005或P<001），CD+4CD+25FoxP3-T和CD+4CD+25FoxP3+T表達水平明顯明顯升高（P<005或P<001）；與模型組比較，雙藤痹痛凝膠高、低劑量組大鼠外周CD+4CD+25T細胞水平顯著升高，同時CD+4CD+25T細胞中FoxP3+T表達水平明顯升高，CD+4CD+25FoxP3+T表達水平顯著下降（P<005或P<001）。而雙藤痹痛凝膠中劑量組除了CD+4T細胞及CD+4CD+25FoxP3+T顯著下降外（P<001），其余無明顯變化。

32 大鼠血清中IL-6表達水平 與正常組比較，模型組的IL-6水平顯著升高（P<001），雙藤痹痛凝膠高、中劑量組與模型組比較，均能顯著降低IL-6表達水平（P<005或P<001），而低劑量組無明顯變化。

4 討論

已有文獻研究表明，CD+4CD+25T細胞的數量減少或者功能的異?？赡苁怯捎谄鋮⑴c了類風濕性關節炎等自身免疫系統疾病的發生[5]，而FoxP3（Forkhead boxP3，FoxP3）則是目前公認的CD+4CD+25T細胞特異性標志，其基因表達調控著免疫T細胞的產生和成熟，一旦CD+4CD+25FoxP3+Treg細胞表達下降，可能直接影響機體免疫耐受，最終導致自身免疫性疾病的發生[6]。因此，研究CD+4CD+25T細胞及其特異性標志物FoxP3，在類風濕性關節炎的治療中具有重要的意義。

本實驗結果表明，雙藤痹痛凝膠在一定劑量下可降低CD+4T細胞水平，同時升高CD+4CD+25T細胞水平和CD+4CD+25T細胞中FoxP3+表達水平，降低IL-6水平。這可能就是前期研究發現，雙藤痹痛凝膠具有抑制CIA模型大鼠足趾腫脹和關節組織病理學改變，降低其關節炎指數作用機制之一。

參考文獻

[1]胡蔭奇.風濕性疾病診斷治療指南[M].1版.北京：中國協和醫科大學出版社，2006：84.

[2]嚴國鴻，黃燕，李煌，等.雙藤痹痛凝膠膏劑對膠原誘導性關節炎模型大鼠的作用[J].中藥藥理與臨床，2014，01：119-121.

[3]郭應強，邱桐，曾昭洋，等.敦煌消痹定痛酊對膠原誘導性大鼠關節炎病理形態學的影響[J].中醫兒科雜志，2007，3（1）：14-16.

[4]趙海梅，劉端勇，程紹民，等.Ⅱ型膠原蛋白對CIA大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+ T細胞的影響[J].細胞與分子免疫學雜志，2011，27（3）：290-291.

[5]MorganME， Sutmuller RPM， Witteveen HJ， et al. CD25+ cell depletion hastens the onset of severe disease in collagen-induced arthritis[J]. Arthritis Rheum， 2003， 48 （5）：1452-1460.

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（編輯：梁志慶）