壓電通道蛋白1調節激素性股骨頭壞死大鼠的成骨細胞凋亡與血管生成

何智軍 何偉 洪志楠 李子褀 魏秋實 陳曉俊 顏新昊

臨床上股骨頭壞死(Osteonecrosis of Femoral Head，ONFH)與過度使用皮質類固醇密切相關，導致骨細胞凋亡和股骨頭結構完整性喪失，并破壞骨血管組織[1-2]。壓電通道蛋白1(Piezoelectric channel protein 1，Piezo1)是骨骼發育和成骨細胞分化所需的關鍵生物力傳感器之一，其功能的發揮與Yes相關蛋白1(Yes associated protein 1，Yap1)密切相關[3]。Piezo1缺失可抑制成骨細胞分化，還改善在發育過程中的骨骼損失，因為Piezo1激活可誘導Yap1和轉錄因子β-連環蛋白(β-catenin)的表達并活化Yap1/β-catenin信號[4]。然而，Piezo1在皮質類固醇誘導ONFH中的表達情況及對骨細胞凋亡和血管生成的調節作用并不明確。

本研究通過類固醇誘導ONFH動物模型，研究沉默Piezo1對ONFH發生的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組處理

48只成年雄性Wistar大鼠(12周齡)購于廣州中醫藥大學實驗動物中心。 每只動物飼養環境為55 cm×35 cm×26 cm的有機玻璃籠子中，光照/黑暗周期12 h/12 h，溫度24～25 ℃，濕度50%～55%。動物自由采食飲水。所有實驗方案均遵守美國國立衛生研究院出版的《實驗動物的護理和使用指南》，并經本院動物研究倫理委員會批準。

經過完全隨機法將所有大鼠分為4組，各12只。1)類固醇激素+siP1組(STE+siP1組)：在第1天用1.5 mL注射器于大鼠股骨遠端松質骨富集處垂直骨面進針，髓腔注射siP1的體內轉染復合物 50 μL，注射完2 h后和24 h后靜脈注射1.8 mg/kg的LPS，并于第3，4，5，6，7天肌肉注射25 mg/kg甲基強的松龍，以促進股骨頭壞死的發展，在第15天再次髓腔注射50 μL siP1體內轉染復合物。2)類固醇激素+siNC組(STE+siNC組)：將髓腔注射的siP1替換為等量的siNC的體內轉染復合物，其余步驟和1)一致。3)類固醇激素組(STE組)：在第1天用1.5 mL注射器于大鼠股骨遠端松質骨富集處垂直骨面進針，髓腔注射生理鹽水50 μL，注射完2 h后和24 h后靜脈注射1.8 mg/kg的LPS，并于第3，4，5，6，7天肌肉注射25 mg/kg甲基強的松龍，以促進股骨頭壞死的發展，在第15天再次髓腔注射50 μL生理鹽水。4)對照組，與1)相同模式相同時間點，用0.9%生理鹽水替代siPiezo1、LPS、甲潑尼龍。最后一次注射甲基強的松龍21 d后，斷頸法處死動物。每組隨機收集6只股骨頭骨新鮮組織用于表達檢測及制作切片。

在4%低聚甲醛-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中固定24 h后，用10%乙二胺四乙酸-0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)將股骨脫鈣5周。脫鈣后，將組織在梯度乙醇中脫水，包埋在石蠟中，沿冠狀平面切成4 μm厚的切片。

1.2 試劑與耗材

Piezo1 siRNA(siPiezo1，siP1)和siRNA陰性對照(siNC)購于上海Genechem公司。甲基強的松龍購于大連輝瑞制藥。杜氏改良培養液(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)/F-12、青霉素、鏈霉素均購于上海碧云天生物科技有限公司。人成骨細胞系(hFOB1.19)和臍靜脈內皮細胞系(HUVEC)購于武漢普諾賽生物科技有限公司。重組人YAP1蛋白(Rh-YAP1)購于美國Abcam公司。β-catenin激活劑(ICG-001)購于美國MedChemExpress公司。PrimeScript RT試劑盒購于大連TaKaRa公司。PCR儀購于北京Eastwin生命科學公司。SYBR Green酶購于深圳富酶泰斯有限公司。Eco Real-Time PCR 系統購于上海Illumina公司。裂解緩沖液購于上海碧云天生物技術研究所。兔抗VEGFR2、CD3、Yap1、β-catenin抗體購于美國Abcam公司。末端標記(Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling，TUNEL)試劑購于南京凱基生物技術公司。

1.3 細胞培養和處理

人成骨細胞系hFOB1.19和臍靜脈內皮細胞系(HUVEC)均培養于DMEM/F-12培養基(20%的BSA、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素)。分別使用1.0 μmol/L重組人YAP1蛋白(Rh-YAP1)及2.5 μmol/L的β-catenin激活劑(ICG-001)處理hFOB1.19細胞和HUVEC細胞 24 h。收集細胞進行后續實驗。

1.4 方法

1.4.1TUNEL分析 通過TUNEL檢測試劑盒檢測股骨頭組織及所培養hFOB 1.19細胞的凋亡。骨組織中具有棕色核的細胞被評估為陽性。對hFOB 1.19細胞則統計TUNEL陽性細胞核的數量和總細胞核數。每組隨機選擇五個高倍視野(×200)來評估凋亡細胞的百分比(凋亡率)。

1.4.2實時定量PCR(qPCR) 用Trizol試劑從大鼠的股骨頭中提取總RNA，檢測260 nm(A260)的吸光度來定量RNA的濃度，通過確定A260/A280比例評估RNA的純度。提取的總RNA(0.84 μg)用PrimeScript RT試劑盒在PCR儀上反轉錄合成cDNA(反轉錄PCR反應條件：16 ℃ 0.5 h，41 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min，4 ℃循環)，cDNA在4 ℃下保存。在PCR擴增之前，將cDNA保持在-20 ℃。qPCR反應在20 μL含有引物和SYBR Green酶反應體系的48孔光學PCR板中進行，條件為在94 ℃下預變性4 min，然后在94 ℃下再次變性45個循環，在60 ℃下退火2 min，并在75 ℃下延伸1 min。目標基因和內參基因GAPDH同板擴增，計算CT值，并使用2-ΔΔCt計算相對表達量。實驗設置6個復孔，并且重復3次。實時定量PCR引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.4.3蛋白質免疫印跡 組織樣本：將股骨頭磨成粉狀，在冷的含苯基甲基磺酰氟的RIPA裂解緩沖液中勻漿。細胞樣本：收集2組的HUVEC細胞，經過超聲裂解。以上樣品經過與上樣緩沖液混合，沸水浴中煮5 min，然后在-20 ℃下保存直至用于電泳。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，并轉移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore Corporation，Bedford，馬薩諸塞州，美國)上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與兔抗Piezo1(1∶500)、血管生成標志物VEGFR2(1∶600)、CD3(1∶800)和Yap1(1∶800)、β-catenin(1∶600)蛋白第一抗體在4 ℃下孵育過夜，而在25 ℃下與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶50 000，武漢博斯特生物技術有限公司) 孵育2 h。使用Super Signal West Pico化學發光底物(Thermo Fisher Scientific Inc.，馬薩諸塞州，美國)對膜上的蛋白進行顯色，通過Geliance 200 Imaging System進行拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。GAPDH作為的內參蛋白。實驗重復3次。

1.4.4管狀結構形成實驗 將HUVEC細胞使用1.0 μmol/L Rh-YAP1及2.5 μmol/L的ICG-001處理24 h，并以5×103/孔的密度接種在Matrigel包被的12 孔板中，在37 ℃條件下孵育。16 h后，每孔拍攝5張照片。使用Image J軟件測量細胞形成的總小管長度，每組實驗3個復孔。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 股骨頭壞死大鼠模型

Micro-CT和HE染色可見STE組軟骨較薄，軟骨表面粗糙不平，部分脫落，骨細胞和骨基質大量減少或丟失，皮質骨和骨小梁內出現壞死的細胞集落和大量空腔，對照(Control)組無上述特征(見圖1)。

圖1 STE誘導大鼠ONFH模型的建立

2.2 沉默股骨頭壞死大鼠體內的Piezo1

與對照(Control)組比，STE組股骨頭骨組織中的Piezo1的mRNA水平以及蛋白水平在3，6，12，24 h都上調，差異有統計學意義(P<0.01)。另外，與STE+siNC組比，STE+siP1組Piezo1的mRNA水平以及蛋白水平在3，6，12，24 h下調，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 Piezo1在股骨頭壞死大鼠中的表達

2.3 Piezo1對股骨頭壞死大鼠成骨細胞凋亡的影響

最后一次注射甲基強的松龍21 d后，對照組中TUNEL凋亡率為5.2%，而STE組凋亡率為90.3%(P<0.01)。與STE+siNC組的凋亡率(89.5%)比，STE+siP1組的凋亡率(37.9%)降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

圖3 Piezo1沉默對 ONFH大鼠股骨頭組織凋亡的影響 (×200)

與對照組比，STE組Bax和Caspase-3的mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)，而Bcl-2 mRNA的表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與STE+siNC組比，STE+siP1組Bax和Caspase-3的mRNA表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)；而Bcl-2 mRNA的表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 Piezo1沉默對ONFH大鼠中凋亡標志基因的mRNA表達量的影響

2.4 微血管形態變化結果分析

與對照組比，STE組的股骨頭內血管體積、血管表面積、血管厚度均降低(P<0.01)；與STE+siNC組比，STE+siP1組股骨頭內血管體積、血管表面積、血管厚度均增多(P<0.01)，見圖5。

圖5 Piezo1沉默對 ONFH大鼠股骨頭組織血管量的影響

與對照組比，STE組VEGFR2和CD31表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與STE+siNC組比，STE+siP1組VEGFR2和CD31表達水平增高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖6。

圖6 Piezo1沉默對VEGFR2和CD31的蛋白表達量的影響

2.5 Piezo1沉默對股骨頭壞死大鼠Yap1/β-catenin信號通路的影響

與對照組的股骨頭骨組織中Yap1和β-catenin的蛋白(1.00±0.03，1.00±0.04)比，STE組(3.43±0.23，3.57±0.44)表達上調，差異有統計學意義(P<0.01)；與STE+siNC組Yap1和β-catenin的表達(3.42±0.55，3.61±0.64)比，STE+siP1組(1.85±0.25，2.71±0.34)降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖7。

圖7 Western Blot檢測Piezo1沉默對Yap1和β-catenin的蛋白表達量的影響

2.6 激活Yap1/β-catenin信號通路促進成骨細胞的凋亡并抑制血管生成能力

與Ctrl(1.00±0.06，1.00±0.05)比，Rh-YAP1組中Yap1和β-catenin的蛋白水平(4.21±0.28，2.23±0.25)都增高，差異有統計學意義(P<0.01)。與對照(Ctrl)組(1.00±0.05)比，ICG-001組β-catenin(4.52±0.45)的蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖8a。

與Ctrl組比，Rh-YAP1組和ICG-001組的細胞凋亡率增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與Ctrl組比，Rh-YAP1組及和ICG-001組的HUVEC細胞管狀結構形成長度均下調，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖8(b，c)。

圖8 激活Yap1/β-catenin信號通路促進成骨細胞的凋亡并抑制血管生成能力

3 討論

類固醇可誘導ONFH[5]，其誘導的細胞凋亡是關鍵原因之一[6]。本研究大鼠接受類固醇激素甲基強的松龍的連續注射后，ONFH模型成功建立。文獻中類固醇所誘導ONFH的股骨頭會出現明顯的骨壞死，其特征在于STE組的骨小梁中有大量的空骨細胞陷落，沒有發現明顯的骨髓壞死，但發現ONFH的骨細胞凋亡率增加[6]，本研究股骨部位骨細胞凋亡率也明顯增加。Huang等[7]在類固醇誘導的ONFH患者被切除的股骨頭部分也觀察到骨細胞凋亡，認為糖皮質激素對股骨頭的松質骨具有直接的細胞毒性作用，導致凋亡而不是單純的壞死。Zheng等[6]在動物實驗中也證明糖皮質激素可以促進成骨細胞和骨細胞的凋亡。凋亡性骨細胞的積累可能導致骨壞死，表明具有抑制骨細胞凋亡潛能的藥物可能具有預防類固醇誘導的ONFH發生的能力。

Piezo1對于骨形成和調節骨吸收發揮關鍵作用[8-10]。因此，本研究對Piezo1在ONFH模型中的表達進行了檢測，觀察到Piezo1的mRNA水平以及蛋白水平在造模后3 h至24 h都上調，說明Piezo1很可能對激素性股骨頭壞死有調節作用，而沉默Piezo1可以抑制股骨頭壞死組織中骨細胞的凋亡。

Bax激活ONFH的骨細胞的凋亡，而Bcl-2選擇性結合Bax的活性構象從而抑制其凋亡[11]。在本研究中，ONFH模型中沉默Piezo1，導致Bax mRNA明顯降低，但Bcl-2 mRNA顯著升高，表明沉默Piezo1可以通過抑制Bax提高Bcl-2從而抑制骨細胞凋亡。Caspase-3是另一種重要的凋亡相關蛋白，屬于Caspase家族，在細胞內凋亡信號的誘導、轉導和擴增中起著至關重要的作用。Caspase-3可被切割形成活性分子促進骨細胞凋亡[11]。在本研究中，ONFH模型中Caspase-3的mRNA升高，意味著由糖皮質激素誘導的骨細胞凋亡是由Caspase-3執行的，而沉默Piezo1可以明顯抑制Caspase-3的表達，進一步表明Piezo1沉默后可抑制骨細胞凋亡。

局部缺血和骨壞死是股骨頭骨壞死的核心病理機制。本研究結果發現，ONFH出現血管減少，且血管新生關鍵蛋白VEGFR2和CD3的表達量下調。而沉默Piezo1可促進大鼠ONFH模型中的股骨頭局部血管的生成，包括血管的體積、表面積和血管厚度在內可觀察到明顯的增加，而且骨組織中VEGFR2和CD3蛋白水平明顯上調。研究證明，Piezo1在胎盤血流敏感性中扮演決定作用，可調節胎盤血流[12]，表明沉默Piezo1可能對ONFH的血管再生有幫助作用。

Yap1和β-catenin信號通路的協同作用已被證實[13-14]，Yap1已被證實可以調節結直腸癌細胞的血管生成[15]，而β-catenin信號在多種腫瘤模型和疾病中參與血管生成的調控，包括股骨頭壞死動物[16-17]。在本研究實驗結果中觀察到，沉默Piezo1明顯抑制Yap1和β-catenin的蛋白表達，從而抑制Yap1/β-catenin信號通路的活性。當使用Yap1的重組蛋白和β-catenin信號激活劑時，成骨細胞的凋亡率明顯上調，而且HUVEC細胞的成管能力部分減弱。說明在成骨細胞中Yap1/β-catenin可能是Piezo1行使功能的關鍵信號路徑，且沉默Piezo1通過抑制Yap1/β-catenin信號改善股骨頭壞死導致的骨細胞凋亡和股骨頭血管生成能力的缺失。

綜上所述，沉默Piezo1通過抗成骨細胞凋亡和促血管生成預防類固醇誘導的ONFH，其潛在機制涉及Bax/Bcl-2、Caspase-3和Yap1/β-catenin信號通路，說明沉默Piezo1是治療ONFH的一種潛在治療方法。