石菖蒲抗癲癇活性成分α-細辛醇鼻腔給藥大鼠的藥代動力學研究

李玥璇，梁麗紅，許茹，程培萱，肖超妮

(西北大學生命科學學院，陜西 西安 710069)

α-細辛醇[反式-3-(2,4,5-三甲氧基苯基)丙-2-烯-1-醇，MW=224]是抗癲癇中藥石菖蒲和“膽南星-石菖蒲”復方中的活性成分，也是“遠志-石菖蒲”及臨床藥物α-細辛腦膠囊體內代謝的核心效應物[1]。依據美國國立衛生研究院實施的抗癲癇藥物開發程序，在3種不同癲癇模型的研究中發現，α-細辛醇的抗癲癇活性優于α-細辛腦膠囊、司替戊醇和卡馬西平而其神經毒性卻較低[2]。α-細辛醇可預防H2O2介導的SH-SY5Y細胞凋亡，具有一定的神經細胞保護作用[3]。α-細辛醇主要通過苯二氮卓結合位點對GABAA受體進行調控、通過抑制神經元細胞和神經膠質細胞LDH活性，從能量代謝角度控制癲癇發生和通過促進氧化物酶體增殖激活受體PPAR-γ發揮活性[4]。2016年，α-細辛醇獲得中國發明專利證書(ZL201410692696.9)。

灌胃給藥α-細辛醇在正常大鼠和癲癇大鼠的生物利用度較低，到達腦內的濃度更低從而影響療效；靜脈注射α-細辛醇在大鼠腦、心、脾、腎臟組織中均有分布，但是腦靶向特性卻不甚清楚[5]。癲癇發作時患者意識喪失、肢體抽搐、精神異常、牙關緊閉，口服或注射等常規給藥方式出現一定的難度，不適合于癲癇發作的急救和自救治療。鼻腔給藥利用大腦和鼻室通過嗅覺/三叉神經通路和外周循環相互連接，繞過血腦屏障將藥物傳遞至大腦，避免胃腸和肝臟代謝提高藥物的生物利用度[6-7]。鼻腔給藥作為腦靶向給藥方式之一，與口服和透皮給藥相比，具有快速起效、非侵入性、易于給藥等優點[8]。

為了探討α-細辛醇鼻腔給藥在抗癲癇疾病方面的可行性，本研究采用高效液相色譜法分析比較鼻腔給藥、靜脈注射和灌胃給藥α-細辛醇后大鼠血漿的藥代動力學特性及腦組織的分布情況，評價3種給藥方式的生物利用度和腦靶向特性，為α-細辛醇抗癲癇創新藥物研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑α-細辛醇(本實驗室合成，純度>99.0%)；α-細辛醚(上海麥克林生化科技有限公司)；吐溫-80(國藥集團化學試劑有限公司)；0.9%生理鹽水(西安京西雙鶴藥業有限公司)；甲醇、乙腈(色譜級，Fisher Scientific)；甲酸、乙醚(分析純，天津市大茂化學試劑廠)。

1.2 動物 SPF級成年雄性Sprague-Dawley大鼠[合格證：SCXK(陜)2018-001]，體重180.0～220.0 g，購于西安交通大學醫學部動物研究中心。置于動物籠飼養，環境溫度保持為(20±2)℃，濕度為45%±3%，晝夜周期為12 h，可自由攝食和飲水。

1.3 儀器 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BF2000氮氣吹干儀(北京八方世紀儀器)；UPD-Ⅱ-10T超純水機(四川優普超純科技有限公司)；TGL-16G高速離心機(上海安寧科學儀器)；SCIENTZ-48高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥液配制 稱取α-細辛醇0.050 0 g，置于研缽中，將1 mL生理鹽水和1 mg吐溫-80分次加入研缽中，研磨至完全溶解，配制α-細辛醇藥液(50 mg·mL-1)用于滴鼻給藥。稱取α-細辛醇0.768 0 g，置于研缽中，將96 mL生理鹽水和1.5 mg吐溫-80分次加入研缽中，研磨至完全溶解，配制α-細辛醇藥液(8 mg·mL-1)用于灌胃給藥和尾靜脈注射給藥。藥液置于4 ℃冰箱冷藏。

1.4.2 動物實驗 動物實驗經西北大學動物倫理委員會批準，符合要求。大鼠72只，禁食12 h，自由飲水，隨機分為滴鼻給藥組、靜脈注射給藥組和灌胃給藥組，每組24只。腹腔注射7%水合氯醛對大鼠進行麻醉，仰臥位固定，在大鼠頸部正中剪開約3 cm切口，用鑷子剝離頸部肌肉，暴露出食道、氣管以及頸動脈血管，肺部端的氣管插入約2 cm的塑料管保證大鼠正常呼吸，頭部端的氣管用細線扎緊。滴鼻給藥組結扎食道、封閉口腔防止藥物進入胃腸道或肺部，α-細辛醇給藥劑量為25 mg·kg-1；靜脈注射給藥組和灌胃給藥組α-細辛醇的給藥劑量分別為25和50 mg·kg-1。

1.4.3 樣品采集與處理 將動物頸動脈血管的近頭端用細線系緊，近心端夾上止血夾，在距離止血夾約0.8 cm處用注射器頭扎孔后，將頸動脈插管插入血管后用細線系緊。在給藥后0、2、5、10、15、20、30、45、60、75、90、120 min取血0.5 mL，取血后立即夾上止血夾，用生理鹽水和肝素沖洗頸動脈插管防止血液凝固。血液經離心(9 000 r·min-1，10 min，4 ℃)后，取上清180 μL置于離心管中，加入內標物α-細辛醚20 μL(50 μg·mL-1)和乙腈600 μL，渦旋混勻，再次離心得上清液，用氮氣流吹干，殘留物用200 μL色譜流動相復溶，渦旋1 min，得血漿樣品用于HPLC測定。

在給藥后2、15、30 min，快速脫頸處死大鼠，低溫下迅速取腦，用生理鹽水沖洗干凈，對嗅區、嗅球、海馬、小腦、大腦皮層分區取材，用濾紙吸干表面水分進行稱重，加入5倍量溶劑(生理鹽水∶甲醇=1∶2)后用組織研磨器進行勻漿。勻漿液經離心(9 000 r·mim-1，10 min，4 ℃)，取上清100 μL置于離心管中，加入乙腈300 μL，再次離心后，上清液用氮氣流吹干，殘留物用100 μL色譜流動相進行復溶，渦旋1 min，得腦組織提取液用于HPLC測定。

1.4.4 色譜條件 采用Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流速為0.7 mL·min-1，檢測波長為314 nm，進樣量為20 μL。流動相為甲醇(B)和2‰甲酸水(A)，血漿樣品的流動相梯度洗脫：40%B→70%B(0～15 min)，70%B→90%B(15～25 min)，腦組織提取液樣品的流動相梯度洗脫：40%B→70%B(0～15 min)。

1.4.5 方法學考察 專屬性：對空白血漿、α-細辛醇溶液(含α-細辛醚)、α-細辛醇和血漿混合液(含α-細辛醚)和灌胃給藥α-細辛醇后的血漿樣品，在相同HPLC檢測條件下進行分析。分別對空白腦組織提取液、α-細辛醇和空白腦組織提取液的混合液、灌胃給藥α-細辛醇后腦組織的樣品溶液，在相同HPLC檢測條件下進行分析。

線性曲線：精密配制α-細辛醇儲備液，稀釋后得到系列標準溶液(1 000、500、250、100、50、25、10、5、2.5、1 μg·mL-1)，取10份空白血漿(160 μL)，加入α-細辛醇各系列標準溶液20 μL和α-細辛醚溶液20 μL(50 μg·mL-1)，得到α-細辛醇(100、50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 μg·mL-1)的血漿混合液，經處理后采用HPLC進行測定，以α-細辛醇與α-細辛醚的色譜峰面積之比值與α-細辛醇的濃度進行回歸擬合，得線性方程。取10份空白組織提取液180 μL，分別加入α-細辛醇系列標準溶液20 μL，得到α-細辛醇(50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1 μg·mL-1)組織提取混合液，經處理后采用HPLC進行測定，以α-細辛醇色譜峰面積與α-細辛醇濃度進行回歸擬合，得線性方程。

精密度和加樣回收率、穩定性：取空白血漿/空白腦組織，加入α-細辛醇標準溶液，配制成低(0.5 μg·mL-1)、中(5.0 μg·mL-1)、高濃度(50.0 μg·mL-1)的樣品。在一天內重復進樣分析(n=6)，計算日內精密度和加樣回收率，連續6 d重復(n=6)進樣分析，計算日間精密度和加樣回收率。在室溫下放置2、4、8 h，考察α-細辛醇的短期穩定性；于-80 ℃下冷凍30、60、90 d后取出，考察α-細辛醇的長期穩定性；于-80 ℃下冷凍24 h，取出，室溫融解，重復操作3次，考察α-細辛醇的凍融穩定性。

2 結果

2.1 方法學考察 圖1為α-細辛醇在血漿樣品中的專屬性考察結果，α-細辛醇與內標物α-細辛醚色譜峰保留時間相差較大，分離度好，且血漿內源性代謝物的色譜峰對其無干擾。圖2為α-細辛醇在不同腦組織中的專屬性考察結果，α-細辛醇色譜峰峰形良好，且腦組織內源性代謝物色譜峰對其均無干擾，分離度較好。這表明采用HPLC方法測定大鼠血漿和腦組織中α-細辛醇的含量時，方法專屬性良好。

A.空白血漿；B.α-細辛醇溶液(含內標物α-細辛醚)；C.含α-細辛醇的大鼠血漿混合溶液(含內標物α-細辛醚)；D.灌胃給藥α-細辛醇后的大鼠血漿

A.空白組織;B.含α-細辛醇的空白組;C.灌胃給藥α-細辛醇后的組織樣品

圖3為α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的標準曲線。其線性方程和相關系數分別為：血漿Y=0.400 3X-0.146 2(R2=0.993 8)；嗅區Y=36.76X-10.17(R2=0.998 9)；嗅球Y=30.10X+15.34(R2=0.993 6)；海馬Y=42.98X-15.59(R2=0.998 8)；小腦Y=21.09X-0.85(R2=0.992 3)；大腦皮層Y=19.48X+24.05(R2=0.993 9)。線性范圍均為0.1～50 μg·mL-1。

圖3 血漿和不同組織樣品中α-細辛醇的標準曲線

表1為α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中日內精密度和日間精密度及相對應的加樣回收率考察結果，α-細辛醇的日內精密度和日間精密度RSD<7.2%，加樣回收率在89%～105%，參照生物樣品的藥物含量限度要求，精密度和回收率良好，表明該方法可靠。

表1 α-細辛醇在血漿和腦組織中的精密度和加樣回收率(Mean±SD，n=6)

表2～4分別為α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的短期、長期和凍融穩定性考察結果?？梢奟SD<11%，回收率在86%～101%，表明α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的短期穩定性、長期穩定性以及凍融穩定性均良好。

表2 α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的短期穩定性

2.2 α-細辛醇的血漿藥代動力學和生物利用度 對給藥后不同時間點的大鼠血漿進行HPLC分析，記錄相應的α-細辛醇色譜峰面積，由線性方程計算血漿中α-細辛醇的濃度。以取血時間點為橫坐標，以α-細辛醇濃度為縱坐標，繪制藥-時曲線(見圖4)?？梢钥闯?，灌胃給藥α-細辛醇在血漿中的濃度先升高再降低，而靜脈注射和滴鼻給藥α-細辛醇在血漿中的變化趨勢相似，均隨著時間增長而逐漸降低。灌胃給藥、滴鼻給藥和靜脈注射分別在45、75、120 min后均未檢測出α-細辛醇。

表3 α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的長期穩定性

圖4 滴鼻給藥(i.n.)、靜脈注射(i.v.)和灌胃給藥(i.g.)α-細辛醇在大鼠血漿的藥-時曲線

表4 α-細辛醇在血漿和腦組織樣品中的凍融穩定性

表5列舉了3種給藥方式下α-細辛醇在大鼠血漿中的藥代動力學參數。滴鼻給藥比靜脈給藥α-細辛醇的藥-時曲線下面積(AUC0～t)稍小，卻是灌胃給藥AUC0～t的2倍。體內平均滯留時間(MRT)依次為靜脈給藥、滴鼻給藥和灌胃給藥，表明α-細辛醇滴鼻給藥在體內停留時間較長。滴鼻給藥與靜脈給藥α-細辛醇后的最大血藥濃度(Cmax)相當，而滴鼻給藥劑量僅為灌胃給藥劑量的1/2，但其Cmax卻較大。滴鼻給藥與灌胃給藥α-細辛醇后血藥濃度達峰時間(Tmax)均為2 min，表明滴鼻給藥吸收迅速。滴鼻給藥和灌胃給藥α-細辛醇后的半衰期(T1/2)幾乎無差別，卻明顯低于靜脈給藥的半衰期；清除率(CL)依次為靜脈給藥、滴鼻給藥和灌胃給藥，發現鼻腔給藥遠大于灌胃給藥在體內的消除速度。根據藥時曲線下面積(AUC)和給藥劑量D，計算滴鼻給藥α-細辛醇的絕對生物利用度為70.57%，而灌胃給藥的絕對生物利用度為19.31%。

表5 不同給藥方式下大鼠血漿中α-細辛醇的藥代動力學參數(Mean±SD，n=6)

2.3 α-細辛醇的腦組織分布及腦靶向性評價 圖5為不同時間點大鼠腦組織中α-細辛醇濃度的變化。當給藥2 min后，滴鼻給藥和靜脈給藥在大鼠5個腦區(嗅區、嗅球、海馬、小腦、大腦皮層)有α-細辛醇的分布，灌胃給藥僅在1個腦區(海馬)有α-細辛醇的分布；當給藥15 min后，滴鼻給藥和靜脈給藥在大鼠4個腦區(嗅區、嗅球、海馬、小腦)有α-細辛醇的分布，灌胃給藥在2個腦區(海馬和嗅區)有α-細辛醇存在，大腦皮層中均未檢測到α-細辛醇；給藥后30 min，滴鼻給藥和靜脈給藥仍在大鼠4個腦區(嗅區、嗅球、海馬、小腦)發現α-細辛醇，而灌胃給藥后在3個腦區(嗅區、海馬、和小腦)有α-細辛醇存在。

圖5 滴鼻給藥(i.n.)、靜脈注射(i.v.)和灌胃給藥(i.g.)大鼠腦組織中α-細辛醇濃度

Bi.v.為靜脈注射給藥大腦AUC，Pi.v.為靜脈注射給藥血漿AUC，PT為其他給藥方式血漿AUC，BT其他給藥方式大腦AUC，當DTP%>0表示藥物具有腦靶向潛能。表6列舉了α-細辛醇在大鼠嗅區、嗅球、海馬、小腦和大腦皮層的DTI和DTP%值。滴鼻給藥α-細辛醇在嗅球、海馬、小腦和大腦皮層的DTI值均大于1且DTP%值均大于0，嗅球的DTI和DTP%顯著高于其他腦區。相比而言，灌胃給藥α-細辛醇在嗅區、海馬和小腦的DTI值大于1且DTP%值大于0，海馬區域的DTI和DTP%高于其他腦區。

表6 大鼠嗅區、嗅球、海馬、小腦和大腦的DTI和DTP值

3 討論

對α-細辛醇在3種給藥方式下大鼠血漿的藥代動力學參數進行了系統分析。滴鼻給藥和靜脈注射α-細辛醇均在2 min達到相近的最大血藥濃度，表明滴鼻的藥物吸收迅速之快，可與靜脈注射的藥物吸收速度相媲美。滴鼻給藥與靜脈給藥α-細辛醇的藥時曲線下面積相近，表明α-細辛醇通過鼻黏膜更好地吸收進入體循環，這可能與α-細辛醇的親脂性和低分子量有關[10]。與灌胃給藥相比，滴鼻給藥α-細辛醇的達峰時間明顯縮短，這與芬太尼鼻腔給藥的藥代動力學特征相似，其鼻腔給藥比灌胃給藥的吸收速度大，具有起效快的特點[11]。滴鼻給藥比灌胃給藥α-細辛醇的最大血藥濃度稍大，這是由于滴鼻給藥劑量僅為灌胃給藥劑量的1/2。文獻報道了α-細辛腦的大鼠口服劑量是鼻腔給藥劑量的4倍時，兩種給藥方式的血藥濃度才比較相近，這表明鼻腔能有效吸收藥物入血[12-13]。滴鼻給藥比灌胃給藥α-細辛醇的平均滯留時間較長，清除速率較小、半衰期幾乎無差別，表明α-細辛醇滴鼻給藥在體內停留時間長，可更好的發揮治療作用。

灌胃給藥α-細辛醇的絕對生物利用度為19.31%，這與文獻報道其在正常大鼠的絕對生物利用度接近[5]。而滴鼻給藥是灌胃給藥α-細辛醇絕對生物利用度的3.6倍。Hussain等[14]發現灌胃給藥普萘洛爾的生物利用度為15%，而鼻腔給藥和靜脈給藥生物利用度相似，且遠大于灌胃給藥。有文獻報道脂溶性藥物咪達唑侖經鼻噴霧劑給藥的絕對生物利用度達到88%[15]。分子量小的化合物(Mw<1 000)鼻腔給藥后吸收效果好、生物利用度較高，親脂性藥物鼻腔給藥后生物利用度明顯高于灌胃給藥，而親水性藥物鼻腔給藥后生物利用度與灌胃給藥幾乎沒有差別，這表明分子量和藥物脂溶性是影響鼻黏膜吸收的重要因素[16]，有機小分子更適合通過鼻內給藥到達循環系統[17]。由此推斷，α-細辛醇鼻腔給藥的絕對生物利用度高，與其分子量小、親脂性好有關。此外，鼻腔給藥途徑可以避免首過效應，也是α-細辛醇鼻腔給藥絕對生物利用度高的主要因素。

滴鼻給藥α-細辛醇在2 min之內快速且均勻地分布到各個腦區，而灌胃給藥在30 min內僅在腦部3個腦區有分布，分布速度較慢且分布量不均勻。滴鼻給藥α-細辛醇在嗅球中藥物濃度明顯高于靜脈注射和灌胃給藥，這與經鼻給藥α-細辛腦在嗅球中的濃度高于其余兩種給藥途經的結果相一致[13]。相比于灌胃給藥，滴鼻給藥α-細辛醇的腦靶向指數和腦靶向潛能較高，表明滴鼻給藥α-細辛醇的腦靶向性更好。這是由于鼻腔給藥后，藥物通過鼻黏膜更好的吸收到嗅覺上皮，繞過血腦屏障直接進入大腦的緣故[18]。從腦靶向指數和腦靶向潛能指標上推斷，α-細辛醇在的腦靶向在嗅球區域，而灌胃給藥腦靶向在海馬區域。

本文建立了血漿和腦組織中α-細辛醇的HPLC測定方法，方法學考察顯示專屬性、回收率、精密度和穩定性均良好，可用于α-細辛醇在大鼠血漿藥代動力學和腦組織的分布研究。鼻腔給藥α-細辛醇具有吸收迅速、體內滯留時間長和生物利用度高等特點，能夠快速分布到海馬、小腦、嗅球和大腦皮層，且在嗅球中的腦靶向性最高。鼻腔給藥α-細辛醇通過嗅球直接從鼻腔的嗅上皮進入腦組織，可以作為一種有效給藥途徑用于癲癇的及時救治。