化肥減量配施微生物菌劑對桑葉產量和主要活性成分含量的影響

俞燕芳 黃金枝 林羨 王亞威王豐 彭曉虹 杜賢明 王軍文

(1.江西省蠶桑茶葉研究所 330202；2.江西省經濟作物研究所 330202；3.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所 510610)

近年來，鑒于化肥過量施用的諸多弊端，全國各地積極開展化肥減施增效技術的研究與應用推廣。微生物菌劑因為在改良土壤、促進植物生長和提高農產品質量等多方面作用顯著正日益受到重視[1～2]。目前商品微生物菌劑主要有發酵類菌劑和功能類菌劑。功能類菌劑由具有解磷、解鉀、固氮、拮抗病害等功能的菌株組成。近年來，微生物菌劑已在多種蔬菜、果樹和中藥材等作物上開展了試驗研究并取得了良好的效果[3～6]。

桑樹是我國一種重要的經濟作物，桑葉中富含蛋白質、碳水化合物和維生素等營養成分，同時還含有多酚和生物堿等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌和抑菌等保健功效，是一種藥食兩用的植物資源[7～8]。研究表明，不同的施肥條件會影響桑樹的生理代謝及活性成分的積累[9～10]。傳統蠶桑產業栽桑的目的是獲取桑葉養蠶，桑樹栽培依賴化肥的現象較普遍，導致土壤肥力下降，肥料利用率降低，桑葉品質下降。目前關于微生物菌劑對桑樹生長及品質影響研究甚少。

本研究在適量減施化肥條件下，通過田間試驗，探究不同微生物菌劑對桑葉產量及其活性成分的影響，以期為微生物菌劑在桑樹栽培上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑樹品種為金十，8年生低干桑?？莶菅挎邨U菌(200億/g)、綠色木霉菌(50億/g)、解淀粉芽孢桿菌(200億/g)和膠質芽孢桿菌(200億/g)購自河南省沃寶生物科技有限公司。復合肥(N∶P2O5∶K2O，17∶17∶17)購自新洋豐農業科技股份有限公司。有機肥(總養分11.24%，有機質84.9%，N為3.36%，P2O5為4.55%，K2O為3.33%)購自福建省綠屯生物科技有限公司。

沒食子酸、蘆丁、1-脫氧野尻霉素(DNJ)標準品和芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚試劑、乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)和乙酸(色譜級)購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SK3310HP超聲清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；FW135高速粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)；1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 施肥處理

試驗于2020年2—10月在江西省南昌市南昌縣黃馬鄉江西省蠶桑茶葉研究所試驗基地進行。試驗區土壤有機質含量為28.2g/kg，全氮1.92g/kg，有效磷6.46mg/kg，速效鉀160.59mg/kg。

選擇樹形、樹勢相近的桑樹，參考微生物肥料田間試驗技術規程及肥效評價指南(NY/T1536—2007)，試驗共設置7個處理，分別定義為處理1(CK0，未施肥)、處理2(CK1，常規施肥)、處理 3(CK2，減量施肥)、處理4(J1，CK2+枯草芽孢桿菌)、處理5(J2，CK2+綠色木霉菌)、處理6(J3，CK2+解淀粉芽孢桿菌)、處理7(J4，CK2+膠質芽孢桿菌)。4月15日和5月27日施肥，穴施。常規施肥為800kg/hm2復合肥。減量施肥為400kg/hm2復合肥和400kg/hm2有機肥。微生物菌劑施用量為有機肥重量的1%。每個處理 3 個小區，每個小區選擇4株作調查。

1.3.2 桑葉產量測定

施肥后，每個處理隨機選擇12株桑樹，分別在4月20日、5月27日、7月18日和9月7日進行桑葉產量調查，4次產量的總和為全年桑葉產量。

1.3.3 桑葉多酚和DNJ含量測定

在每次調查產量時，每個處理分別隨機采集相同葉位的嫩桑葉200g左右，60℃烘干后測定總酚和DNJ含量。 DNJ提取及含量測定方法如下[11]：稱取0.1g桑葉粉在10mL離心管中，加 0.05mol/L 鹽酸 3mL，渦旋1min后超聲30min，10 000rpm 離心10min，取上清液。重復以上步驟提取一次，合并2次上清液，用 0.05mol/L 鹽酸定容至10mL。在5.0mL離心管中加入100μL提取液(或不同濃度DNJ標準溶液)和100μL硼酸鉀緩沖液(0.4mol/L， pH值8.5)，再加入200μL的 FMOC-Cl溶液 (5mmol/L)，混勻后 25℃水浴反應 20min，加入100μL甘氨酸(1mol/L)終止反應，再加入100μL醋酸水(1%)及400μL超純水，以0.45μm 微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜(HPLC)測定DNJ含量。液相色譜條件為：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm× 250mm，5μm)，進樣量10μL，流動相為乙腈：0.1% 醋酸(1∶1，v/v)，流速 0.5mL/min，柱溫25℃，熒光檢測器激發波長254nm，發射波長322nm。以峰面積和對應 DNJ 標準溶液的質量濃度為坐標繪制 DNJ 標準曲線，根據標準曲線線性回歸方程計算每個樣品的 DNJ 含量。

桑葉多酚提取及含量測定方法如下：稱取干燥桑葉粉 0.5g，加入80%乙醇15mL，超聲提取30min，10 000r/min 離心15min，取上清液。重復以上步驟提取2次，合并3次上清液，用 80% 甲醇定容至50mL，作為酚類物質提取液待測?？偡雍繙y定方法如下[12]：以沒食子酸溶液為標準對照，樣品測定結果表示為mg沒食子酸當量/g 干重(mgGAE/g DW)。將25μL標準品或樣品加入到96孔酶標板中，再加入125μL福林-酚試劑(0.2N)，室溫下反應10min后加入125μL的飽和Na2CO3溶液，在振蕩器上緩慢搖勻后室溫放置 30min，然后在 765nm下測定吸光度。

1.3.4 數據分析

用IBM SPSS Statistics 22.0進行數據統計分析，結果以平均值±標準差表示。采用單因ANOVA進行平均值比較，利用Duncan法進行差異顯著性分析，用OriginPri8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同微生物菌劑對桑葉產量的影響

如圖1所示，CK0處理(未施肥)的桑葉產量最低，J3處理(CK2+解淀粉芽孢桿菌)的產量最高。與CK1處理(常規施肥)相比，CK2(減量施肥)的桑葉產量下降了0.1kg/株。J1(CK2+枯草芽孢桿菌)、J2(CK2+綠色木霉菌)、J3(CK2+解淀粉芽孢桿菌)和J4(CK2+膠質芽孢桿菌)的桑葉產量均高于CK2。但是，各處理組的桑葉產量無顯著性差異(P>0.05)。

圖1 不同微生物菌劑處理桑葉產量比較

2.2 不同微生物菌劑對桑葉多酚含量的影響

如圖2所示，在試驗期內不同處理組桑葉的多酚含量總體均呈下降趨勢。在5月27日，CK2處理桑葉多酚含量顯著高于CK1，J2處理和J4處理桑葉多酚含量與CK2沒有顯著性差異(P>0.05)，J1和J3多酚含量顯著低于CK2(P<0.05)。在7月18日，J3多酚含量顯著低于其他處理組(P<0.05)。在9月7日，與CK2相比，J4多酚含量顯著增加，而J2和J3多酚含量顯著降低(P<0.05)。

圖2 不同微生物菌劑處理桑葉多酚含量比較

由此可見，在不同的生長時期，微生物菌劑對桑葉多酚的含量存在不同程度的影響。在減量化肥的基礎上，施用膠質芽孢桿菌劑(J4)能夠增加桑葉多酚含量，而施用解淀粉芽孢桿菌劑(J3)會降低桑葉多酚含量。

2.3 不同微生物菌劑對桑葉DNJ含量的影響

如圖3所示，在試驗期內桑葉中的DNJ含量呈先上升后下降的趨勢，在7月18日采摘的桑葉DNJ含量最高。在7月18日和9月7日，CK2桑葉的DNJ含量顯著高于CK0和CK1，與CK2相比，J1顯著增加桑葉DNJ含量(P<0.05)。在7月18日，與CK2相比，J3顯著降低桑葉DNJ含量(P<0.05)。在9月7日，與CK2相比，J4顯著降低桑葉DNJ含量(P<0.05)。J2和CK2在5月27日差異不顯著，但在7月18日開始差異顯著(P<0.05)。由此可見，減量施肥可以增加桑葉DNJ含量，不同微生物菌劑會影響桑葉DNJ的合成與積累，施用枯草芽孢桿菌劑(J1)和綠色木霉菌劑(J2)能夠增加桑葉DNJ含量，而施用解淀粉芽孢桿菌(J3)和膠質芽孢桿菌劑(J4)會降低桑葉DNJ含量。

圖3 不同微生物菌劑處理桑葉DNJ含量比較

3 討論與結論

施肥是提高桑葉產量和改善桑葉品質的主要手段。有研究表明，在減量化肥基礎上增施有機肥和微量元素能夠改善土壤理化性狀，提高桑樹光合性能，提高果桑產量和果實品質[9]。本試驗結果表明，增施微生物菌劑，可以提高桑葉產量，但影響不顯著，這可能與微生物菌劑施用的濃度以及大田環境復雜性有關。杜紅[13]研究表明，中等濃度膠質芽孢桿菌(0.10g菌劑/kg土)顯著提高油菜產量，高濃度(1.00g菌劑/kg土)會抑制油菜的生長[13]。

多酚和DNJ是桑葉中的重要活性成分，是桑葉發揮降血糖、降血脂和抗菌消炎等功效的重要物質基礎[14～15]。本試驗結果表明，施用微生物菌劑顯著影響桑葉中的多酚和DNJ含量。其中，施用膠質芽孢桿菌劑(J4)能夠增加桑葉多酚含量，而降低桑葉DNJ含量；施用解淀粉芽孢桿菌劑(J3)會降低桑葉多酚和DNJ含量；施用枯草芽孢桿菌劑(J1)和綠色木霉菌劑(J2)能夠增加桑葉DNJ含量。這可能與微生物菌劑影響光合作用從而影響植物的代謝活動有關。汪晶晶等[16]研究發現，海洋解淀粉芽孢桿菌GM-1菌劑處理水稻，水稻葉片中總酚和黃酮含量明顯提高。王愛斌等[17]研究表明，酵素菌肥、EM菌堆肥、木霉菌制劑、枯草芽孢桿菌制劑和阿維菌素有機肥，都能促進藍莓葉片氮、磷、鉀、葉綠素、可溶性蛋白、可溶性糖和總酚的積累。葉如夢等[18]比較了在不同土壤養分(貧瘠組、營養組)條件下，灌根接種內生枯草芽孢桿菌B117對香蜂花生長生理及總酚、總黃酮、迷迭香酸含量的影響，結果表明在營養組中接菌能顯著降低營養組總酚和迷迭香酸含量，而在貧瘠土壤中接菌效果并不顯著?？梢?，微生物菌劑對植物次生代謝物的影響因植物種類、栽培環境等條件不同而不同。

綜上，在減量施肥基礎上施用一定劑量的枯草芽孢桿菌劑(J1)或綠色木霉菌劑(J2)，能夠促進桑葉DNJ的合成與積累，而施用膠質芽孢桿菌劑(J4)，可促進桑葉多酚的積累，其作用機制還有待于進一步研究。