HPV E6/E7 mRNA、Ki-67在宮頸上皮內瘤變中的表達

蔣笑霞，李紅梅，俞旭云，王福智

（寧?？h婦幼保健院，浙江 寧海 315600）

宮頸癌一般由宮頸上皮內瘤變（CIN）發展而來，人乳頭狀瘤病毒（HPV）是與宮頸病變密切相關的球形DNA病毒[1]，其中E6、E7為高危型HPV早期轉錄因子。研究發現，持續性高危型HPV感染可致E6、E7蛋白大量表達，增加宮頸組織高級別病變風險，HPV E6/E7 mRNA多作為反映HPV致癌基因活躍狀態的指標[2]。細胞增殖相關核蛋白（Ki-67）與腫瘤細胞增殖相關，研究表明，Ki-67表達與CIN呈正相關[3]。本研究探討了HPV E6/E7 mRNA與Ki-67在不同級別CIN中的表達，并分析其臨床意義，旨在為臨床提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月-2020年3月本院收治的89例子宮頸病變患者。納入標準：（1）18-65歲；（2）有性生活史；（3）接受病理組織學檢查、HPV E6/E7 mRNA及Ki-67檢測；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）既往CIN史、陰道及宮頸治療史、放化療史、HPV感染史；（2）處于妊娠期或哺乳期；（3）合并宮頸外的其他惡性腫瘤；（4）合并肝腎等功能不全、免疫系統疾病、凝血功能障礙；（5）既往接受免疫抑制劑治療。根據組織病理學檢查結果，根據宮頸上皮內瘤變的級別進行分組[4]，其中CIN1級組18例、CIN2級組31例、CIN3級組26例和宮頸鱗狀細胞癌組14例。選取同期本院收治的23例子宮良性病變患者為對照組，術中取正常子宮頸組織作為對照。各組年齡、孕次、產次比較差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。研究經本院倫理會批準，且患者知情同意。

表1 各組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 標本收集 （1）宮頸細胞：檢測前3天無性生活、無陰道沖洗或用藥，經期內患者擇期檢查；利用一次性窺陰器充分暴露患者宮頸，清理宮頸口分泌物后，宮頸細胞刷順時針輕旋轉收集脫落細胞；置于宮頸細胞保存液（美國Hologic公司）4℃保存。（2）宮頸組織：手術收集宮頸組織，以10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋；連續切片，層厚4μm，48℃展片。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 取宮頸細胞，采用熒光PCR染料法行HPV-DNA檢測，操作按照HPV-DNA檢測試劑盒（博奧生物集團有限公司，貨號340020）說明書，熒光PCR儀（美國ABI公司，型號7500）定量分析，以≥500拷貝數為陽性，反之為陰性。采用轉錄介導的等溫擴增法（TMA）進行HPV E6/E7 mRNA檢測，操作按照HPV E6/E7 mRNA試劑盒（美國Hologic公司，貨號 10210）說明書，根據分析物信號與閾值之比（S/CO）進行判讀，S/CO≥1.0為陽性，反之為陰性。

1.2.3 Ki-67檢測 取宮頸組織切片，采用免疫組化SP染色法檢測；常規脫蠟，置于3%過氧化氫溶液處理5分鐘；蒸餾水沖洗3次，浸入0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，高壓加熱至噴汽3分鐘，冷卻后用PBS溶液（福州邁新生物技術開發有限公司，貨號PBS-0061）沖洗1-2次；滴加Ki-67單克隆抗體（福州邁新生物技術開發有限公司，貨號：MAB-0672），4℃過夜；PBS溶液沖洗2分鐘，滴加HRP標記鼠/兔二抗（福州邁新生物技術開發有限公司，貨號：Kit-5030）30℃ 15分鐘；PBS溶液沖洗 1次/min，連續3次；按照DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，貨號：DAB-1031）說明書操作，蘇木素復染1分鐘后依次行脫水、透明和封片處理，顯微鏡下觀察染色情況；以細胞核內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，反之為陰性。

1.3 觀察指標 比較各組HPV E6/E7 mRNA和Ki-67的表達情況，并分析HPV E6/E7 mRNA和Ki-67陽性表達率與宮頸上皮內瘤變級別的相關性。

1.4 統計學處理 采用SPSS20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料用（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，三組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Snk-q檢驗。計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗。HPV E6/E7 mRNA和Ki-67陽性表達率與宮頸病變程度相關性采用Spearman秩相關分析。

2 結果

與對照組比較，CIN1級組、CIN2級組、CIN3級組及宮頸鱗狀細胞癌組HPV E6/E7 mRNA、Ki-67陽性表達率升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。HPV E6/E7 mRNA及Ki-67陽性表達率與宮頸病變程度呈正相關（rHPVE6/E7mRNA=0.712，P＜0.01；rKi-67=0.698，P＜0.01）。 詳見表 2。

表2 各組HPV E6/E7 mRNA、Ki-67的表達[n（%）]

3 討論

宮頸鱗狀細胞癌為宮頸癌常見病理類型，其發生發展是一個漸進過程，多由宮頸不典型增生發展而成[5]。HPV持續感染已被證實與宮頸病變密切相關，且為宮頸鱗狀細胞癌發生的獨立危險因素[6]。HPV基因組包括早期基因區、晚期基因區和長調控區，E6和E7是位于HPV早期基因區的致癌基因，其編碼的蛋白可致宮頸上皮癌變，并在病變進一步發展過程中參與病毒DNA復制、轉錄，促進宮頸癌變[7]。Ki-67是與腫瘤細胞增殖相關抗原，其陽性率越高提示腫瘤細胞有絲分裂數高，生長較快，組織分化能力就差。Min等[8]研究發現，宮頸癌和CIN2-3級患者宮頸組織Ki-67表達水平高于CIN1級，宮頸癌Ki-67表達水平高于CIN2-3級，Ki-67表達水平與HPV感染呈正相關，提示檢測Ki-67對于CIN和早期宮頸癌診斷具有一定臨床價值。

本研究采用支鏈DNA信號擴增法檢測宮頸組織HPV E6/E7 mRNA表達，發現宮頸病變組織HPV E6/E7 mRNA陽性表達率增加，符合以往研究結果[9]，相關性分析提示，HPV E6/E7 mRNA表達與宮頸病變程度呈正相關，提示HPV E6/E7基因過度表達可能與CIN和宮頸癌變過程有關，分析原因為E6/E7基因編碼致癌蛋白與細胞內p53和pRb兩種主要抑癌蛋白結合，調控和改變細胞生長周期及DNA修復，使宿主細胞基因組有游離狀態逐漸以整合狀態存在，最終導致宮頸癌變[10]。本研究采用免疫組化SP染色法檢測不同宮頸病變組織Ki-67，發現子宮頸病變組織Ki-67陽性表達率增加，與以往研究結果一致[11]，相關性分析顯示，Ki-67表達與宮頸病變程度呈正相關，機制可能與癌細胞上皮間充質轉化及細胞自噬有關[12]。

綜上，HPV E6/E7 mRNA和Ki-67在子宮頸病變組織中陽性表達率較高，且與病變程度呈正相關，臨床可行HPV E6/E7 mRNA和Ki-67檢測，以便早期發現宮頸上皮惡性變，進一步提高患者預后。