鼻咽癌hMLH1基因甲基化及其與臨床和病理特征的關系

肖士東，劉艷鋒，周詳，姜順明

（建德市第一人民醫院，浙江 建德 311600）

錯配修復基因功能缺陷是腫瘤發生的重要因素。在其產生異變時，錯配修復功能缺失，進一步影響DNA復制及合成，造成遺傳的不穩定性，最終引起細胞的癌變。近年來，相關研究證實相關區域的GpG島甲基化可能會導致腫瘤抑制基因失活[1]，DNA甲基化可能影響抑癌基因和錯配修復基因，具體而言就是腫瘤抑制基因和錯配修復基因啟動子區域CpG島的甲基化可能阻礙啟動子與轉錄因子的結合，從而促進腫瘤的發生和發展[2]。目前，國內暫無鼻咽癌中hMLH1基因啟動子甲基化的相關研究。本文應用甲基化特異性PCR（MSP）和亞硫酸氫鹽修飾后測序（BSP）測定1個正常鼻咽上皮細胞株及20例正常鼻咽上皮組織、5個鼻咽癌細胞株及60例鼻咽癌組織hMLH1基因啟動子區甲基化水平，分析hMLH1基因啟動子區甲基化狀態和鼻咽癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 60例鼻咽癌組織標本均為本院2012年5月-2016年5月初次確診的患者，20例正常鼻咽上皮組織來自本院行鼻中隔矯正術患者鼻腔后上段近鼻咽部組織，另選本院1例體檢健康者的外周血淋巴細胞作為陽性對照。60例鼻咽癌患者年齡 23-74 歲，平均（43.2±5.7）歲，其中男 32 例，女28例；TNM分期T1-T2期 45例，T3-T4期15例。N0期26例，N1-N3期34例；臨床分期：Ⅰ-Ⅱ期24例，Ⅲ-Ⅳa期36例；病理分型：低分化鱗癌43例，未分化癌17例。5個鼻咽癌細胞株（CNE1、CNE2、TWO2、HNE1、HONE1）全部購于上海雅吉生物有限公司，正常鼻咽上皮細胞株NP69購于上海澤葉生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學預測 在線使用NCBI檢測hMLH1在基因組的位置，METH-PRIMER軟件分析hMLH1啟動子區有無典型CpG島，同時在線設計MSP及BSP特異性引物。

1.2.2 DNA及RNA的提取 （1）提取組織細胞DNA：使用蛋白酶K消化，再使用酚/氯仿抽提，最后使用乙醇沉淀方法提取DNA。（2）提取組織及細胞RNA：制備組織勻漿和細胞，加入0.2mL氯仿，12000r/min離心5分鐘，離心后將上層水相移入新管中，加入0.5mL異丙醇12000r/min離心10分鐘，將EP管中的上清液倒出，加入1mL乙醇混勻，8000r/min離心5分鐘，每個EP管中加入30μL的DEPC水，放入55℃～60℃水浴鍋中水浴10分鐘，水浴完畢后取出RNA。

1.2.3 hMLH1的表達 qRT-PCR檢測細胞及組織中提取后的RNA hMLH1的相對表達。在冰塊上行逆轉錄?；靹蛳嚓P試劑后在PCR儀上65℃加熱5分鐘，取出置冰上。往冷卻后的MIX中加入配置的逆轉錄反應液，配成總體積20μL，置PCR儀上42℃加熱60分鐘，95℃ 5分鐘，4℃ 10分鐘，取出-20℃保存。制定定量PCR反應MIX，引物由上海生物工程技術服務有限公司設計合成，使用BIORED熒光定量PCR儀器，反應程序95℃3分鐘預變性；95℃12秒，62℃40秒，共40個循環。結果使用2-△△Ct計算其相對表達量。

1.2.4 外周血DNA的CpG甲基化酶修飾 1μg DNA加入2μL 10×反應緩沖液，1單位的CpG甲基化酶和0.1μL 200×S-腺苷甲硫氨酸，RP管中加DEPC水至20μL，在37℃溫育1個小時，再進行下一步DNA的亞硫酸氫鹽修飾，用于陽性對照。

1.2.5 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 亞硫酸氫鹽修飾鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織、鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞株，以及外周血淋巴細胞中提取的DNA及使用CpG甲基化酶處理過的DNA。外周血淋巴細胞中提取的DNA經亞硫酸氫鹽修飾后用于非甲基化陽性對照模板。BSP引物F:5'-TTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTA-3'，R 5'-CCCAAAAAAAACAAAATAAAAATC-3'。PCR反應后，瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，回收PCR產物，將PCR純化產物連接到pUC18-T載體，連接產物轉化，藍白斑篩選，質粒提取后測序。

1.2.6 甲基化特異性PCR hMLH1基因甲基化和非甲基化引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。甲基化引物F：5'-TTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTAC-3'，R 5'-ACTAAACACGAATACTACGAACGAT-3'；非甲基化引物F:5'-TTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTAT-3'，5'-ACTAAACACAAATACTACAAACAAT-3'，甲基化特異性PCR程序：95℃ 3分鐘， 使用 94℃ 30秒、60℃ 20秒、72℃ 20秒，共37個循環，延伸72℃5分鐘。非甲基化特異性PCR程序：引物95℃3分鐘，使用94℃30秒、58℃ 20秒、72℃ 20秒，共 37個循環，延伸 72℃ 5分鐘。再使用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。正常外周血淋巴細胞DNA作為非甲基化陽性對照，CpG甲基化酶修飾后正常外周血淋巴細胞DNA模板作為甲基化陽性對照，水作為空白對照。

1.2.7 5-Aza-2'-deoxycytidine（5-Aza-dC）處理細胞株 當細胞長滿細胞瓶70%時候，用5μM 5-Aza-dC處理鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞株72小時，每隔24小時換液1次。處理后的細胞進行相關細胞學實驗。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件處理數據，計量資料采用（±s）表示，并采用 t檢驗；甲基化陽性率及其與臨床病理參數的差異采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測 hMLH1基因表達水平hMLH1在5個鼻咽癌細胞株中的相對表達量較在1個正常鼻咽上皮細胞株中明顯少（圖1），hMLH1在鼻咽癌組織中的相對表達量較正常鼻咽上皮組織中明顯少，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖 2）。去甲基化藥物5-Aza-dC處理鼻咽癌和正常鼻咽上皮細胞株后hMLH1的表達量與正常鼻咽上皮細胞株相比不再明顯降低（圖3）。

圖1 hMLH1在5個鼻咽癌細胞株和1個正常鼻咽上皮細胞株的相對表達量

圖2 鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織中的hMLH1基因表達水平

圖3 5-Aza-dC處理細胞株后hMLH1在鼻咽癌細胞株和正常鼻咽上皮細胞株中的相對表達量

2.2 hMLH1基因啟動子區域甲基化分析 采用NCBI檢測 hMLH1在基因組位置（圖 3），hMLH1位于人3號染色體上，具體位置：NC_000003.12（36993487.37050846）。METH-PRIMER 軟件分析hMLH1啟動子區（hMLH1第一外顯子前約2000bP）有無典型CpG島。同時在線設計MSP及BSP特異性引物（圖 4-5）。

圖4 hMLH1在基因組中的位置

圖5 hMLH1啟動子區存在典型的CpG島及MSP引物設計

2.3 hMLH1基因的甲基化狀態 正常鼻咽上皮細胞株及20例正常鼻咽上皮組織中均未檢測到hMLH1基因甲基化；而在5個鼻咽癌細胞株中有4例（80.0%）有hMLH1甲基化現象，60例鼻咽癌組織中有26例（43.3%）有hMLH1甲基化現象，兩者比較差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖6）。使用亞硫酸氫鹽修飾后測序（BSP）檢測5個鼻咽癌細胞株和1個正常鼻咽上皮細胞株中hMLH1基因的甲基化狀態，每株細胞3個克隆。發現在5個鼻咽癌細胞株中有4個鼻咽癌細胞株表現為啟動子區CpG島高甲基化，1個鼻咽癌細胞株和1個正常鼻咽上皮細胞株未甲基化（圖7）。結果與甲基化特異性 PCR（MSP）一致。

圖6 hMLH1啟動子區存在典型的CpG島及BSP引物設計

圖7 MSP檢測hMLH1基因的甲基化狀態

PCR擴增產物電泳可以出現以下三種情況，使用甲基化引物擴增出目的條帶，而非甲基化引物的擴增產物未出現條帶，這種情況為甲基化;非甲基化特異性引物擴增出條帶，而甲基化引物的擴增產物未出現條帶，即為未甲基化；如果甲基化和非甲基化引物都擴增出條帶，這種情況為半甲基化或者部分甲基化。M使用甲基化引物；U：使用非甲基化引物；MSP：甲基化特異性 PCR；CNE1、CNE2、TWO2、HNE1、HONE1為鼻咽癌細胞株；NP69：正常鼻咽上皮細胞株；T1-4：鼻咽癌組織；N1-2：正常鼻咽上皮組織。 結果提示：CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、T1、T2、T4為甲基化標本；TWO3、NP69、T3、N1、N2為非甲基化標本。詳見圖8。

圖8 5個鼻咽癌細胞株和1個正常鼻咽上皮細胞株甲基化情況及位點

2.4 hMLH1基因甲基化與臨床和病理特征的關系鼻咽癌中hMLH1基因甲基化與hMLH1基因非甲基化患者間臨床病理特征差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表 1。

表1 鼻咽癌hMLH1基因甲基化與臨床和病理特征的關系

3 討論

鼻咽癌與多種基因突變和表觀遺傳畸變有關[3]。研究表明，啟動子CpG島上的異常DNA甲基化是鼻咽癌發展和進展的基礎。此外，越來越多的證據表明，許多基因主要被鼻咽癌上皮細胞的DNA甲基化所沉默[4-5]。鑒別差異DNA甲基化基因有助于了解發病機制，開發可用的生物學標志物，早期診斷鼻咽癌同時優化和個性化治療鼻咽癌。據報道[6]，在鼻咽癌組織和細胞中，DACT1基因的表達與甲基化狀態有關，通過調節甲基化狀態和調節腫瘤細胞的生長和侵襲來改變甲基化狀態。相關研究報道[7-10]，在散發性大腸癌、頭頸惡性腫瘤、胃癌等多種腫瘤中均存在錯配修復系統的異常，其中以hMLH1基因的啟動子區甲基化最常見。近年來，陸續有關于鼻咽癌中微衛星不穩定的研究報道表明鼻咽癌存在錯配修復系統的異常，但是否也存在“hMLH1基因啟動子區異常甲基化”目前為止國內尚未報道。本研究通過檢測hMLH1基因的表達及其啟動子區甲基化呈現的狀態探討hMLH1基因同鼻咽癌臨床病理特征之間的關系，旨在找出可能作為鼻咽癌早期分子生物學診斷的標志物。

研究結果提示，正常鼻咽上皮細胞株及20例正常鼻咽上皮組織中均未檢測到hMLH1基因甲基化，而在5個鼻咽癌細胞株中hMLH1甲基化頻率為80.0%（4/5），60例鼻咽癌組織中hMLH1甲基化頻率為43.3%（26/60），兩者與正常對照比較差異均有統計學意義（P＜0.01），表明hMLH1基因啟動子區甲基化只發生在鼻咽癌組織和細胞株中，具有高度的腫瘤特異性，進一步分析還發現其甲基化狀態與臨床和病理特征之間均無明顯相關性（P＞0.05），提示甲基化狀態為鼻咽癌早期事件。使用亞硫酸氫鹽修飾后測序（BSP）檢測5個鼻咽癌細胞株和1個正常鼻咽上皮細胞株 （每株細胞3個克?。┲衕MLH1基因的甲基化狀態，發現5個鼻咽癌細胞株中有4個鼻咽癌細胞株表現為啟動子區CpG島高甲基化，1個鼻咽癌細胞株和1個正常鼻咽上皮細胞株未甲基化，結果與MSP一致。鼻咽癌細胞及組織中hMLH1其啟動子區域甲基化程度較高，而正常鼻咽上皮細胞株及組織中未檢出hMLH1其啟動子區域甲基化，說明鼻咽癌的發生可能和hMLH1啟動子區域甲基化程度有關。但是，作者也發現極少數鼻咽癌細胞株及組織hMLH1啟動子區域甲基化程度較低，甚至未出現甲基化，這一現象是否與“腫瘤病理種類、分級以及個體差異”有關有待進一步研究。隨后使用去甲基化藥物5-Aza-dC處理鼻咽癌細胞株，正常鼻咽上皮細胞株后再次檢測hMLH1的表達量發現鼻咽癌細胞株中hMLH1的表達量與正常鼻咽上皮細胞株相比不再明顯降低，說明hMLH1的表達量可能受其啟動子區域甲基化程度所調控。

另外，本研究結果還表明，甲基化狀態與年齡、性別、臨床分期、病理類型等均無明顯關系，與Wong等[11]報道符合。

hMLH1在鼻咽癌腫瘤組織及細胞中低表達，有抑癌作用，hMLH1的表達量可能受其啟動子區域甲基化程度所調控。臨床上用甲基化藥物重新激活其表達可以抑制鼻咽癌的癌變，具有潛在的基因治療價值。