金雀異黃素調控miR-199a-5p 表達抑制卵巢癌SKOV3 細胞的糖酵解

曹小妹，樂伊婕，林佳芝，寧舒婷，邱葉貝，曹建國，楊劍鋒，寧映霞

（1.湖南師范大學醫學院，長沙 410013；2.廣州醫科大學附屬第一醫院，廣州 510120）

癌細胞的能量代謝重編程主要表現為有氧糖酵解，亦稱為沃伯格效應，是惡性腫瘤的一個標志［1］。在包括卵巢癌在內的多種類型腫瘤中，miR-199a-5p 呈低表達狀態并且發揮抑癌作用［2］。我們先前證實，金雀異黃素，一種大豆及其制品的主要活性成分具有抗卵巢癌活性［3］。盡管已有研究報告金雀異黃素通過抑制肝細胞癌HIF-1α/GLUT1/HK2 信號軸介導的糖酵解誘導肝細胞癌細胞死亡［4］，然而，金雀異黃素能否調控卵巢癌細胞miR-199a-5p 表達和糖酵解仍然有待深入研究。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與處理 人卵巢癌細胞系SKOV3 細胞購自中國科學院細胞庫（中國上海市）。按照先前文獻的描述［3］，細胞用含10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素G和鏈霉素溶液的DMEM 細胞培養基，置37°C、飽和濕度的5% CO2 培養箱中單層貼壁生長；此外，我們用預備實驗確定的亞細胞毒濃度的金雀異黃素（genistein，GEN：20、40μM）處理SKOV3 細胞24 小時。

1.2 miRNA 轉染 如先前文獻［5］的方法，按照制造商的說明（RiboBio，中國廣州市），用iboFECT?CP 試劑轉染micrON?miR-199a 模擬物或抑制物（50 nM）（RiboBio，中國廣州，cat. no.miR112111170919-1-5）入SKOV3 細胞。此外，按照上述轉染的方法和步驟完成miR-199a 模擬物（miR-NC）的陰性對照或miR-199a 抑制物（Anti-Cont）的陰性對照的轉染。

1.3 qRT-PCR 參考文獻［2］的實驗方法，用miRcute miRNA 分離試劑盒（cat. DP501，Tiangen Biotech，中國）制備總microRNA?；赥aqMan MicroRNA 分析（Applied Biosystems）的All-in-One?miRNA qRTPCR 檢測試劑盒轉錄和擴增總miRNA（2μg），以測定microRNA 的量。U6 RNA 用作內參。用2-ΔΔCt方法分析結果。miR-199a-5p 和內參 U6 引物如下：

1.4 乳酸產物和葡萄糖消耗的測定實驗 根據文獻［6］的方法，使用不含酚紅的DMEM 培養基培養腫瘤細胞24 小時后收集細胞培養液。然后，用葡萄糖檢測試劑盒測定細胞培養液中的葡萄糖濃度根據與對照組相比的葡萄糖濃度差異確定葡萄糖消耗量。乳酸檢測試劑盒檢測細胞培養液中的乳酸水平。

1.5 統計學分析 各組實驗數據錄入SPSS 20.0 for windows evaluation 軟件建立數據庫，所有數據用均數±標準差 表示，采用One Way ANOVA 方差分析；多組均數比較采用Dunnett's t test 檢驗。P<0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 細胞的糖酵解 乳酸產物和葡萄糖消耗測定實驗結果顯示，miR-199a-5p 轉染顯著降低卵巢癌SKOV3 細胞的乳酸產生（圖1 A；P<0.05）和葡萄糖消耗量（圖1B；P<0.05）。

圖1 miR-199a-5p對SKOV3細胞糖酵解的影響與培養基處理SKOV3細胞（Ctrl）相比：* P<0.05；與miR-199a-5p 模擬物陰性對照（miR-NC）轉染的SKOV3細胞相比：# P<0.05（mean±SD，n=3）。

2.2 金雀異黃素上調卵巢癌SKOV3 細胞miR-199a-5p 表達 實時熒光定量PCR 實驗結果表明，與0.1 %DMSO 處理SKOV3 細胞相比，亞細胞毒濃度的金雀異黃素（20.0μM、40μM）顯著上調SKOV3 細胞 miR199a-5p 表達水平；并且金雀異黃素上調miR-199a-5p 表達的作用呈濃度依賴趨勢（P<0.05），結果見圖2。

圖2 金雀異黃素對SKOV3細胞miR-199a-5p表達的影響與溶媒（0.1% DMSO）處理SKOV3細胞相比：* P<0.05；與20.0μM金雀異黃（GEN）處理SKOV3細胞相比，# P<0.05（mean±SD，n=3）。

2.3 金雀異黃素抑制卵巢癌SKOV3 細胞的糖酵解乳酸產物和葡萄糖消耗測定實驗結果表明，金雀異黃素減少卵巢癌SKOV3 細胞的乳酸產生（圖3 A；P<0.05）和葡萄糖消耗（圖3 B；P<0.05）。

圖3 金雀異黃素對SKOV3細胞糖酵解的影響與溶媒（0.1% DMSO）處理的SKOV3細胞相比：* P<0.05（mean±SD，n=3）。GEN：金雀異黃素。

2.4 miR-199a-5p 抑制物救援金雀異黃素抑制SKOV3 細胞糖酵解作用 乳酸產物和葡萄糖消耗測定實驗結果顯示，miR-199a-5p 抑制物轉染顯著增加卵巢癌SKOV3 細胞乳酸產生（圖4 A；P<0.05）和葡萄糖消耗（圖4 B；P<0.05），并且miR-199a-5p 抑制物能消除金雀異黃素減少卵巢癌SKOV3 細胞乳酸產生和葡萄糖消耗的作用（圖4 A 和4B；P<0.05）。

圖4 金雀異黃素聯合miR-199a-5p抑制物對SKOV3細胞糖酵解的影響與miR-199a-5p抑制物陰性（Anti-Ctrl）對照轉染SKOV3細胞相比：* P<0.05；與單獨金雀異黃素（GEN，40μM）處理的SKOV3細胞相比：#P<0.05；與單獨miR-199a-5p抑制物轉染的SKOV3細胞相比：$ P<0.05（mean±SD，n=3）。

3 討論

腫瘤細胞的葡萄糖有氧酵解也稱為Warburg 效應，在維持腫瘤細胞生存和發展中起關鍵作用［1］。近來的研究表明miRNAs 可作為抑癌因子調節腫瘤細胞的糖酵解［7，8］。但是抑癌性miR-199a-5p 對卵巢癌糖酵解的作用仍不清楚。在本文的研究中，我們的結果與Li 等人［9］在肝細胞癌中的研究結果一致，miR-199a-5p 減少卵巢癌SKOV3 細胞乳酸產生和葡萄糖消耗，這些結果表明miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 細胞的糖酵解。

金雀異黃素是在大豆和其他大豆產品中大量發現的一種異黃酮。我們先前的研究已經證明它能抑制卵巢癌的干性特征［3］，但金雀異黃素對卵巢癌SKOV3 細胞miR-199a-5p 表達及糖酵解的影響未見相關報道。在本文的研究中，我們率先發現亞細胞毒濃度的金雀異黃素不僅以濃度依賴趨勢上調卵巢癌SKOV3 細胞miR-199a-5p 表達水平，并且能有效地抑制糖酵解。有趣的是，當我們用miR-199a-5p 抑制物聯合金雀異黃素處理SKOV3 細胞，發現miR-199a-5p 抑制物能大部分消除金雀異黃素抑制SKOV3 細胞糖酵解作用，提示金雀異黃素可能通過上調miR-199a-5p 抑制卵巢癌SKOV3 細胞的糖酵解。然而金雀異黃素為何能調控卵巢癌細胞miR-199a-5p 表達及糖酵解有待進一步研究。

總之，我們的研究結果清楚的表明金雀異黃素能誘導卵巢癌SKOV3 細胞miR-199a-5p 表達以及抑制糖酵解。這為金雀異黃素抗卵巢癌作用提供了新實驗參數和理論依據；而且建議miR-199a-5p 有望成為靶向代謝特征治療卵巢癌的一個新靶點。