TRIM74對流感病毒復制機制影響的研究

葉苗苗，孫 楠，李奇兵，石文軍，王 波，王廣文，姜 麗，陳化蘭，李呈軍

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/農業農村部動物流感重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱 150069）

流感病毒作為一種重要的人畜共患病毒，在感染人畜后常引起上呼吸系統疾病，具有季節性和地方性流行的特征，且存在禽流感病毒（Avian influen?za virus，AIV）跨物種感染人的病例，因此對人畜健康和養禽業經濟發展造成重大威脅。該病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據其核蛋白（NP）和基質蛋白（M1）抗原性的不同，分為A（甲）、B（乙）、C（丙）、D 4 型[1]。此外，基于病毒表面抗原HA 和NA的抗原特性，可以將流感病毒分為H 亞型和N 亞型，迄今為止，已發現至少18 個HA 亞型和11 個NA亞型[2]。流感病毒粒子表面有囊膜，呈多形性，含8個編碼病毒蛋白的單股負鏈RNA 片段，且每個RNA片段都能與一個核蛋白NP 和一個聚合酶組成一個病毒核糖核蛋白復合體（vRNP）[3]，該結構是流感病毒基因組轉錄和復制的基本單位?，F有的研究表明，流感病毒通過與宿主蛋白形成復雜的互作網絡進而對病毒的復制產生正向或負向的選擇壓力，從而在病毒基因組的復制、病毒粒子的組裝以及子代病毒粒子的釋放等多個環節發揮重要作用。因此，深入挖掘影響流感病毒復制的宿主依賴因子（Host depen?dent factors，HDFs）并闡明其作用機制，將有利于完善宿主與流感病毒間的互作網絡，并明確宿主因子參與流感病毒復制周期的階段，從而為流感的防控與治療提供理論依據。

三基序（Tripartite motif，TRIM）家族蛋白泛指一類N 端結構域排列高度保守的E3 泛素連接酶，該類蛋白N 端包含RING-B-box-coiled-coil 結構域，又稱RBCC 結構域；C 端包含高度可變的結構域，是每種TRIM 蛋白的特異性標志[4]。TRIM 家族蛋白存在于所有真核生物體內，且其數量與物種等級密切相關。研究表明，蒼蠅基因組編碼約10種TRIM蛋白，豬基因組編碼約57 種TRIM 蛋白，而人類基因組編碼超過80 種TRIM 蛋白，這些蛋白廣泛參與細胞周期、增殖、凋亡、分化、基因表達、轉錄調節、信號傳遞、損傷修復、炎癥反應等生命活動的調控[4-5]。近年來，TRIM 家族蛋白在抗病毒和先天免疫信號調節中發揮作用的研究成為熱點，已有研究發現部分TRIM 家族蛋白以不同的方式調控流感病毒的復制，如TRIM22能夠通過與流感病毒核蛋白NP 的互作使NP 發生泛素化降解從而抑制流感病毒的復制[6]；TRIM14 可以有效阻斷核蛋白NP 從細胞質易位到細胞核，從而抑制流感病毒在宿主細胞中的傳播[7]；TRIM35 通過激活腫瘤壞死因子受體相關因子3（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3）以及降解流感病毒PB2 蛋白負調控流感病毒的復制[8]。

TRIM74 是TRIM 家族蛋白中的成員，目前尚無TRIM74 與病毒、TRIM74 與宿主天然免疫反應相關的研究報道，其功能尚待探究。根據TRIM74 C 端的可變區，將其劃分至TRIM 家族第Ⅴ-2 亞類，與TRIM74 同處于該亞類的TRIM 家族蛋白有TRIM31、TRIM40、TRIM56，對這幾個TRIM 蛋白的研究較廣泛，并且它們分別靶向宿主先天性免疫反應信號通路中的不同接頭分子[9-11]，其中TRIM56 可以通過阻礙病毒RNA 的合成進而抑制甲型和乙型流感病毒的復制[12]。TRIM74 是否與處于同一亞類的上述TRIM 具有相似功能尚不清楚。因此，本研究通過siRNA 干擾TRIM74 的表達；同時通過慢病毒包裝過表達系統構建表達TRIM74 的細胞系，分別利用該細胞系及轉染TRIM74 表達質粒上調TRIM74 的表達，探究TRIM74蛋白對流感病毒復制及干擾素信號通路的影響，為進一步了解TRIM74 蛋白的功能提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及質粒AIV A/WSN/1933（H1N1）株（以下簡稱WSN 株）、仙臺病毒（SeV）、干擾素刺激反應原件（ISRE）啟動子熒光素酶報告質粒pISRELuc 由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室保存；IFN-β 啟動子熒光素酶報告質粒pIFN-β-Luc 購自Addgene 公司；人非小細胞肺癌細胞（A549）購自ATCC 公司；人胚胎腎細胞（HEK293T）和犬腎傳代細胞（MDCK）、pCDNA3.1 載體、pCDNA3.1-TRIM74-V5 表達質粒（簡稱pTRIM74-V5）、海參熒光素酶質粒pRL-TK、慢病毒過表達載體pLVX-IRES-ZsGreen1（簡稱pLVX）以及輔助質粒pASPI2、pMDG2 均由本實驗室保存。

1.2 抗體及主要試劑poly(I:C)購自Invivogen 公司，終濃度為0.5 μg/mL；兔抗V5單克隆抗體（MAb）購自Millipore 公司；兔抗GAPDH MAb 和鼠抗TRIM74 MAb購自Proteintech公司；Alexa FluorTM488 兔抗小鼠IgG（H+L）（A21206）購 自Thermo Fisher 公 司；Dy?Light800 山羊抗鼠IgG 和DyLight680 山羊抗兔IgG 購自KPL 公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑、RNAi Max 轉染試劑購自Invitrogen 公司；5×SDS 蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript?RII Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）購自Vazyme 公司；Opti-MEM 培養基、10×MEM 培養基均購自Gibco 公司；F-12K 培養基購自WISENT 公司；DMEM 培養基購自Sigma 公司；RNA 提取試劑盒購自TIANGEN 公司；細胞活力檢測試劑盒Cell Titer-Glo kit、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega 公司。

1.3 引物及siRNA的設計與合成根據NCBI中TRIM74基因序列（378108），設計并合成靶向TRIM74 的特異性siRNA 以及陰性對照NC siRNA，序列見表1。根據NCBI 中人源IFNB1 基因（3456）、ISG56 基因（3434）、TRIM74 基因（378108）序列，利用Primer Premier 6.0軟件設計合成相應的熒光定量PCR（qPCR）引物及TRIM74 擴增引物（表1）。siRNA 由上海吉瑪基因公司設計并合成，qPCR 引物及克隆引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.4 siRNA 干擾TRIM74 的表達對流感病毒復制影響的檢測

1.4.1 TRⅠM74 siRNA干擾效率的qPCR檢測 將siTRIM74-331和陰性對照NC siRNA 各取30 pmol（1.5 μL），利用RNAiMAX 轉染試劑分別轉染A549 細胞，置于37 ℃、5% CO2培養48 h 后用Buffer RZ 裂解細胞，收獲細胞樣品并提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA 后作為模板，利用表1中的hTRIM74-qPCR引物經qPCR檢測TRIM74的轉錄水平，以GAPDH作為內參校準，以2-ΔΔCt法分析數據結果。

表1 siRNA及引物序列Table 1 siRNA and primers sequences

1.4.2 siRNA 干擾TRⅠM74 的表達后對細胞活力影響的檢測 按1.4.1 中的方法將siTRIM74-331 和NC siR?NA 分別轉染A549 細胞，并將細胞鋪于透光的96 孔細胞培養板內，置于37 ℃、5% CO2培養。48 h 后利用細胞活力檢測試劑盒檢測干擾TRIM74 的表達對細胞活力的影響。

1.4.3 siRNA 干擾TRⅠM74 的表達后對流感病毒復制影響的噬斑滴定檢測 按照1.4.1 中的方法將si?TRIM74-331 和NC siRNA 分別轉染A549 細胞，置于37 ℃、5% CO2培養。48 h 時，將AIV WSN 株以MOI 0.01 感染細胞，分別于感染后24 h、48 h 收集細胞上清，采用文獻中病毒噬斑滴定方法[13]，檢測干擾TRIM74 的表達對流感病毒復制的影響。

1.5 過表達TRIM74 對流感病毒復制影響的檢測

1.5.1 TRⅠM74 過表達細胞系的構建與鑒定 提取A549 細胞總RNA 并反轉錄為cDNA 作為模板，利用表1 中的TRIM74-pLVX 引物對經PCR 擴增TRIM74 基因，并將其克隆至慢病毒過表達載體pLVX 中，構建pLVX-TRIM74 質粒。經測序比對鑒定正確后，將pLVX-TRIM74 和 輔 助 質 粒pASPI2、pMDG2 共 轉 染HEK293T 細胞包裝成慢病毒，同時轉染pLVX 空載體和輔助質粒作為對照。48 h 后收集慢病毒侵染A549細胞，12 h 后補加含10% FBS 的F-12K 培養基繼續培養，48 h 后再利用流式細胞術分選綠色熒光強度高的細胞，經過多次傳代培養，獲得過表達TRIM74基因的細胞系（A549-pLVX-TRIM74）以及對照細胞（A549-pLVX）[14]。分別提取上述兩種細胞總RNA 反轉錄為cDNA 后作為模板，經1.4.1 中的qPCR 鑒定這兩種細胞系；取相同數目的該兩種細胞，經1×SDS蛋白上樣緩沖液裂解后，分別以鼠抗TRIM74 MAb（1∶1 000）、兔抗GAPDH MAb（1∶1 000）作為一抗，DyLight680 山羊抗兔IgG（1∶10 000）和DyLight800 山羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，經western blot 鑒定這兩種細胞中TRIM74 蛋白的表達。

1.5.2 過表達TRⅠM74對流感病毒復制影響的噬斑滴定檢測 將A549-pLVX-TRIM74細胞和對照A549-pLVX細胞分別鋪于12 孔板，待細胞密度為80%時，將WSN 株以MOI 0.01 感染細胞，分別于感染后24 h、48 h 收集細胞上清，按照1.4.3 的方法進行噬斑滴定，檢測過表達TRIM74 對流感病毒復制的影響。

1.6 流感病毒感染對宿主細胞內源TRIM74 mRNA轉錄水平及其蛋白表達影響的檢測

1.6.1 流感病毒感染對內源TRⅠM74 mRNA 轉錄水平影響的qPCR 檢測 將A549 細胞和HEK293T 細胞分別鋪于12 孔板，待細胞長滿單層后，將WSN 株以MOI 5 分別感染上述兩種細胞，分別于感染后0、3 h、6 h 和9 h 收獲細胞樣品并提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA 作為模板，利用表1 中的hTRIM74-qP?CR、GAPDH-qPCR 引物，經qPCR 檢測內源TRIM74 mRNA 的轉錄水平。

1.6.2 流感病毒感染對內源TRⅠM74 蛋白表達影響的western blot 檢測 將WSN 株以MOI 5 分別感染12 孔板中長滿單層的A549 細胞和HEK293T 細胞，設未感染病毒的細胞為陰性對照，37 ℃培養9 h 后裂解細胞，按照1.5.1 中的western blot 方法檢測上述兩種細胞中內源TRIM74 蛋白的表達水平。

1.7 過表達TRIM74對相應干擾素分泌水平影響的檢測

1.7.1 過表達TRⅠM74 對細胞中ⅠFN-β 和ⅠSRE 啟動子活性影響的雙熒光素酶試驗 將pTRIM74-V5表達質粒以不同劑量（0、50 ng、100 ng、200 ng）分別轉染HEK293T 細胞，24 h 后裂解細胞，取裂解液經SDS-PAGE 電泳后，分別以兔抗V5 MAb（1∶1 000）、兔抗GAPDH MAb（1∶1 000）為一抗，以DyLight680 山羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，經western blot 檢測TRIM74 的過表達。在確定TRIM74 呈劑量依賴性過表達后，將本實驗分為兩組：將上述不同劑量的pTRIM74-V5 表達質粒及pCDNA3.1 空載體（陰性對照）分別與pRL-TK、pIFN-β-Luc 報告質粒共轉染HEK293T 細胞（1 組）；另一組將上述不同劑量的pTRIM74-V5表達質粒及pCDNA3.1空載體（陰性對照）分別與pRL-TK、pISRE-Luc報告質粒共轉染HEK293T細胞（2 組）。37 ℃培養24 h后分別以SeV（MOI 1）感染上述各組細胞，感染12 h后裂解細胞，10 000 r/min，室溫離心10 min 后，取20 μL 上清加入96 孔板，利用GloMax 96 Microplate Luminometer 生物化學發光儀檢測各組細胞的雙熒光素酶活性，分析過表達TRIM74對IFN-β 和ISRE 啟動子活性的影響。所有實驗組至少重復檢測3 次。

1.7.2 過表達TRⅠM74 對ⅠFN-β 和ⅠSG56 mRNA 轉錄水平影響的qPCR 檢測 將pTRIM74-V5 表達質粒轉染HEK293T 細胞，同時以轉染pCDNA3.1 空載體的細胞作為陰性對照，24 h 后分別采用SeV 和poly(I:C)刺激細胞，并分別設未經SeV 和poly(I:C)刺激的上述各組細胞作為Mock 組。12 h 后收獲細胞提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA 作為模板，采用表1 中的引物hIFNB1-qPCR、hISG56-qPCR 和GAPDH-qPCR，經qPCR分別檢測各組細胞中IFN-β和ISG56的轉錄水平。

1.8 干擾TRIM74 表達對相應干擾素分泌水平影響的qPCR 檢測分別將siTRIM74-331 和陰性對照NC siRNA 轉染HEK293T 細胞，24 h 后，分別將pRLTK+pIFN-β-Luc 報告質粒和pRL-TK+pISRE-Luc 報告質粒轉染上述各組細胞，24 h 后分別采用SeV 和poly(I:C)刺激細胞，并分別設未經SeV 和poly(I:C)刺激的上述各組細胞作為Mock 組。12 h 后，采用1.7.2 中的qPCR 方法分別檢測上述細胞中IFN-β 和ISG56 mRNA 的轉錄水平。

1.9 數據的統計與分析所有數據均采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析，以t檢驗比較各組間的差異。ns表示P＞0.05，差異不顯著；*表示P＜0.05，差異顯著；**表示P＜0.01、***表示P＜0.001、****表示P＜0.0001，差異均極顯著。

2 結 果

2.1 siRNA 干擾TRIM74 的表達對流感病毒復制影響的檢測結果將siTRIM74-331 與對照NC siRNA 分別轉染A549 細胞后，經qPCR 檢測siTRIM74-331 的干擾效率，并利用細胞活力檢測試劑盒檢測干擾TRIM74 的表達對細胞活力的影響。結果顯示，與轉染對照NC siRNA 的細胞相比，轉染siTRIM74-331 的A549 細胞中TRIM74 mRNA 的轉錄水平下降了62.70%（P＜0.0001）（圖1A），但不影響細胞活力（P＞0.05）（圖1B），表明siTRIM74-331 干擾效果較好，可以用于后續試驗。將siTRIM74-331 與對照NC siRNA 分別轉染A549 細胞，48 h 后用WSN（MOI 0.01）感染細胞，分別于感染后24 h和48 h收獲上清進行噬斑滴定，結果顯示，與轉染NC siRNA 的對照組相比，干擾TRIM74 的表達再感染WSN 株24 h、48 h 后細胞中的病毒滴度分別下降5.21%和61.19%（P＜0.001）（圖1C），表明下調TRIM74 的表達可以抑制流感病毒的復制。

圖1 siRNA干擾TRIM74的表達對流感病毒復制影響的檢測結果Fig.1 The results of the effect of siRNA interference with the expression of TRIM74 on influenza virus replication

2.2 過表達TRIM74 對流感病毒復制影響的檢測結果構建的重組質粒pLVX-TRIM74 經測序鑒定正確后與輔助質粒共轉染HEK293T 細胞包裝成慢病毒，48 h 后收獲慢病毒侵染A549 細胞，48 h 后利用流式細胞術分選陽性細胞，多次傳代后，通過qPCR 和western blot 鑒定獲得的細胞。結果顯示，該細胞中TRIM74 基因的轉錄水平及其蛋白的表達水平較轉染空載體及相應輔助質粒獲得的對照細胞均明顯升高（圖2A、圖2B），表明TRIM74 基因過表達細胞A549-pLVX-TRIM74 以及對照細胞A549-pLVX 均正確構建。將WSN（MOI 0.01）分別感染這兩種細胞，感染后24 h、48 h 分別收集上清經病毒的噬斑滴定。結果顯示，A549-pLVX-TRIM74 細胞中的病毒滴度分別為9.13×105pfu/mL 與2.03×106pfu/mL，對照細胞相應時間的病毒滴度分別為4.73×105pfu/mL 與1.07×106pfu/mL，前者相較后者分別上升了1.93 倍（P＜0.01）和1.90 倍（P＜0.05）（圖2C），表明過表達TRIM74 蛋白可以促進流感病毒的復制。

圖2 過表達TRIM74對流感病毒復制影響的檢測結果Fig.2 The results of the effect on influenza virus replication by overexpression of TRIM74

2.3 流感病毒感染對細胞中內源TRIM74 mRNA 的轉錄水平及其蛋白表達影響的檢測結果將WSN 株（MOI 5）分別感染A549 細胞和HEK293T 細胞后，分別利用qPCR（感染后不同時間）和western blot（感染后9 h）檢測內源TRIM74 mRNA 的轉錄水平及其蛋白的表達水平。結果顯示，與未感染的對照細胞相比，流感病毒感染后的A549 細胞和HEK293T 細胞中TRIM74 mRNA 的轉錄水平隨感染時間的延長而增加（P＜0.001、P＜0.01）（圖3A、圖3C）；其蛋白表達水平也均明顯增加（圖3B、圖3D），表明流感病毒感染會刺激細胞中內源TRIM74 蛋白的表達，推測細胞可能通過上調TRIM74 蛋白的表達以某種方式響應流感病毒的感染。

圖3 流感病毒感染對細胞中內源TRIM74的轉錄水平及其蛋白表達影響的檢測結果Fig.3 Detection results of the effect of influenza virus infection on the transcription level of endogenous TRIM74 and its protein expression in cells

2.4 過表達TRIM74 對干擾素分泌水平影響的檢測結果

2.4.1 過表達TRⅠM74 對細胞中ⅠFN-β 和ⅠSRE 啟動子活性影響的雙熒光素酶試驗結果 將不同劑量的pTRIM74-V5 轉染HEK293T 細胞，24 h 后，經western blot 檢測TRIM74 的過表達。結果顯示，TRIM74 在細胞中的表達量呈劑量依賴性的增加（圖4A）。將上述劑量的pTRIM74-V5 與pRL-TK、pIFN-β-Luc 共轉染HEK293T細胞（1組）；同時將上述劑量的pTRIM74-V5 與pRL-TK、pISRE-Luc 共 轉 染HEK293T 細 胞（2組）。24 h后用SeV（MOI 1）感染上述細胞，12 h后采用雙熒光素酶試劑盒檢測雙熒光素酶活性，分析過表達TRIM74 對IFN-β 和ISRE 啟動子活性的影響。結果顯示，轉染空載體的對照細胞在感染SeV后IFNβ 和ISRE 啟動子被顯著激活，而1 組和2 組細胞中IFN-β 和ISRE 啟動子的活性均顯著下降（P＜0.0001、P＜0.0001），且隨pTRIM74-V5 轉染量的升高二者的活性均呈下降趨勢（圖4B、圖4C）。表明過表達TRIM74 能夠抑制SeV 誘導的IFN-β 和ISRE 啟動子的激活作用。

圖4 過表達TRIM74對IFN-β和ISRE啟動子活性影響的雙熒光素酶試驗結果Fig.4 The results of the effect on IFN-β and ISRE promoter activities detected by dual-luciferase assay in over-expressing TRIM74 cells

2.4.2 過表達TRⅠM74 對ⅠFN-β 和ⅠSG56 轉錄水平影響的qPCR 檢測結果 將pTRIM74-V5 轉染HEK293T細胞，24 h 后分別采用SeV 和poly(I:C)刺激細胞，12 h 后采用qPCR 分別檢測各組細胞中IFN-β 和ISG56 mRNA 的轉錄水平。結果顯示，SeV 和poly(I:C)刺激后的各組細胞中IFN-β mRNA 的轉錄水平均顯著高于Mock 組細胞，且轉染pTRIM74-V5 細胞中IFN-β 的轉錄水平均極顯著低于轉染空載體的陰性對照細胞（P＜0.01、P＜0.001）（圖5A、圖5B）；各組細胞中ISG56 mRNA 的轉錄水平與上述結果均一致（P＜0.0001、P＜0.01）（圖5C、圖5D）。上述結果表明，過表達TRIM74 能夠抑制相應干擾素基因的轉錄水平。

圖5 過表達TRIM74對IFN-β和ISG56轉錄水平影響的qPCR檢測結果Fig.5 qPCR detections of the effect on IFN-β and ISG56 transcription level by over-expressing TRIM74

2.5 干擾TRIM74 的表達對IFN-β和ISG56 轉錄水平影響的qPCR 檢測結果將siTRIM74-331 與對照NC siRNA 分別轉染HEK293T 細胞，48 h 后分別采用SeV 和poly(I:C)刺激細胞，12 h 后經qPCR 檢測IFN-β和ISG56 mRNA的轉錄水平。結果顯示，與Mock組細胞相比，SeV和poly(I:C)刺激后的各組細胞中IFN-β和ISG56 的mRNA 水平均顯著升高，且轉染siTRIM74-331 細胞中IFN-β 的轉錄水平均顯著高于轉染空載體的陰性對照細胞（P＜0.0001、P＜0.0001）（圖6A、圖6B）；各組細胞中ISG56 mRNA 的轉錄水平與上述結果均一致（P＜0.05、P＜0.0001）（圖6C、圖6D），表明下調表達TRIM74 顯著促進相應干擾素基因的轉錄水平。結合2.4 的結果表明，TRIM74 能夠負調控細胞中相應干擾素的分泌水平。

圖6 siRNA干擾TRIM74的表達對IFN-β和ISG56轉錄水平影響的qPCR檢測結果Fig.6 qPCR detections of the effect on IFN-β and ISG56 transcription level by silencing the expression of TRIM74 with siRNA

3 討 論

流感的控制策略依賴于疫苗接種，但流感病毒亞型眾多、變異迅速，需要及時更新疫苗種毒[15]，且目前的抗病毒藥物如金剛烷胺等也正在失去效力[16]。因此，迫切需要探究AIV 新的抗病毒機制，并基于這些機制開發新的治療藥物。根據流感病毒復制所需的宿主依賴因子（HDF）的特性設計藥物或小分子抑制劑干預HDF 的促病毒復制功能，可有效對抗流感病毒并最大限度地減少耐藥病毒株的出現。

TRIM 家族蛋白含有保守的RING-B-box-coiledcoil 結構域，并廣泛參與細胞的生物學過程，且部分TRIM 能夠調節宿主細胞的先天免疫反應，并參與其對病原的識別及免疫信號傳導過程[17]。目前關于TRIM74 蛋白尚無相關研究報道，其蛋白功能有待探究。因此，本研究對TRIM74 是否參與宿主的抗流感病毒感染及其天然免疫調節進行了初步探究。

本研究采用噬斑滴定試驗證明siRNA 干擾TRIM74 的表達后能夠抑制流感病毒的復制。由于重組質粒在流感病毒靶細胞A549 中的轉染效率低，所以本研究構建了TRIM74 蛋白的過表達細胞A549-pLVX-TRIM74 和對照細胞A549-pLVX，并進一步通過噬斑滴定試驗證明過表達TRIM74 能夠促進流感病毒的復制，表明TRIM74 為流感病毒復制的HDF。本研究采用qPCR 及western blot 證實流感病毒感染細胞后會刺激細胞內源TRIM74 的轉錄及表達，推測宿主細胞可能通過增加TRIM74 的表達并以某種方式參與調控流感病毒的復制。

相關研究表明I 型干擾素和III 型干擾素在宿主抗病毒感染的先天性免疫反應中發揮重要作用[18]，流感病毒侵入宿主細胞后，病毒RNA 能夠被宿主細胞內視黃酸誘導基因I（RIG-I）識別并使其發生構象變化從而釋放其N 端的半胱天冬酶激活和募集結構域（CARDs）[19]，進而招募線粒體抗病毒接頭蛋白（MAVS）啟動宿主的天然免疫信號傳導，從而誘導干擾素的分泌[20]。經誘導產生的干擾素通過與宿主細胞不同受體結合后激發不同的信號轉導通路，進而刺激下游效應蛋白的產生，通過這些效應蛋白最終發揮抗病毒作用[21]。因此，本研究探究了TRIM74 對細胞中相關干擾素分泌水平的影響。本研究將常用于刺激宿主細胞IFN-β 和ISRE 啟動子活性的SeV、poly(I:C)作為刺激物刺激過表達TRIM74的細胞后，分別利用雙熒光素酶活性試驗和qPCR檢測細胞中IFN-β和ISRE 啟動子活性及其mRNA 的轉錄水平。結果顯示，過表達TRIM74 能夠抑制SeV 和poly(I:C)誘導的IFN-β 和IRES 啟動子的激活及二者mRNA 的轉錄水平。本研究又通過siRNA 干擾細胞中TRIM74 的表達后，分別利用SeV 和poly(I:C)刺激細胞，再經qPCR 檢測細胞中IFN-β 和ISG56 mRNA 的轉錄水平，結果顯示，干擾TRIM74的表達促進二者mRNA的轉錄水平。上述結果表明，TRIM74能夠負調控細胞中相應干擾素的分泌水平。由此推測，流感病毒感染細胞后刺激內源TRIM74表達的增加，表達的TRIM74通過抑制干擾素的生成導致干擾素介導的信號通路下游效應蛋白表達的降低，從而有利于流感病毒在宿主細胞中的復制，其具體機制有待后續深入挖掘。

此外，TRIM74 具有保守的指環（RING）結構域，一般認為RING 結構域具有E3泛素連接酶活性，通過與相關的E2泛素結合酶共同作用于靶蛋白并對靶蛋白進行泛素化修飾，從而發揮其抗病毒功能[22]。但目前對TRIM74蛋白功能的研究很少，TRIM74是否依賴于其E3泛素連接酶活性參與調控流感病毒的復制及宿主的免疫調節尚不清楚。后續將對TRIM74 調控流感病毒復制的具體階段及其E3 泛素連接酶活性在調控流感病毒復制中的作用做深入研究。本研究為TRIM74蛋白功能的研究和流感的防控提供了參考依據。