基因A型和B型牛鼻病毒雙重熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應用

周昱行，湯 承，岳 華

（西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

牛鼻病毒（Bovine rhinitis virus，BRV）是小RNA病毒科口蹄疫病毒屬成員，為無囊膜單股正鏈RNA病毒[1]。該病毒引起牛鼻甲、氣管和肺上皮的損傷，是牛呼吸道疾病綜合征（Bovine respiratory dis?ease complex，BRDC）的重要病原[2-4]。根據病毒基因組序列，可將BRV 劃分為基因A 型（BRAV）和基因B型（BRBV）2 個基因型[5]，BRAV 的致病性比BRBV強[6]。對犢牛人工感染BRAV 后，感染牛出現了發熱、精神沉郁、局灶性鼻炎、肺炎等典型的呼吸道癥狀[6-8]。如今，BRV 已經廣泛分布于歐洲、亞洲、美洲和非洲共9 個國家，檢出率最高可達52.7%[9]，成為牛呼吸道疾病的重要病原[10]。

BRV 基因組全長約7.2 kb～7.5 kb，編碼4 個結構蛋白（VP1～VP4）和8 個非結構蛋白（Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D），其3D 基因相對保守，是目前BRV 最常用的檢測靶基因，但其在2個基因型間差異較大，二者基因序列平均同源性僅為55.8%，無法設計檢測BRV的通用型PCR引物。目前已發表的4種BRV的檢測方法均為靶向檢測BRAV或BRBV 3D基因的單一熒光定量RT-PCR[10-13]，尚無同時檢測BRAV和BRBV 的雙重熒光定量RT-PCR 方法。由于小RNA 病毒5'非翻譯區（5'NTR）含內部核糖體進入位點（IRES），介導病毒基因組與宿主細胞內核糖體的結合[14-15]，3'非翻譯區（3'NTR）包含與負鏈RNA 合成有關的順式作用元件，這2 個區域的基因序列分別在BRAV 和BRBV 中較為保守[16-17]。本研究對GenBank登錄的全部9 條BRAV 基因序列和全部21 條BRBV 基因序列進行了比對分析，發現BRAV 5'NTR 序列的平均同源性為91.7%，其3D 基因序列的平均同源性為83.8%；而BRBV 3'NTR 序列的平均同源性為95.67%，其3D 基因序列的平均同源性為86.48%，表明NTR 更適合作為BRV 的分子檢測靶標。本研究根據BRAV 5'NTR 和BRBV 3'NTR 分別設計引物和探針，建立同時檢測BRAV 和BRBV 的雙重熒光定量RT-PCR 方法，并將其應用于臨床樣品的檢測，為BRDC 的診斷和防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病毒/細菌核酸和臨床樣品BRAV 和BRBV 核酸由本實驗室檢測并經測序鑒定；D 型流感病毒（IDV）、牛冠狀病毒（BCoV）、牛病毒性腹瀉病毒1 型（BVDV-1）、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛副流感病毒3 型（BPIV-3）、牛腺病毒3 型（BAdV-3）、牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、大腸桿菌和沙門菌等病原的核酸樣品由西南民族大學動物醫學實驗室保存。43 份BRDC 病牛鼻拭子樣品于2020 年10 月～2021 年10 月采自四川省、河北省和吉林省，其中32 份來自四川省的2 個牛場，8 份來自河北省的1 個牛場，3 份來自吉林省的1 個牛場，所有樣品于-80 ℃保存。

1.2 載體及主要試劑pMD19-T載體、QIAamp Viral RNA Mini Kit 購 自QIAGEN 公 司；Premix ExTaq購 自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒、Maxima H Minus Dou?ble-Stranded cDNA Synthesis Kit 購自ThermoFisher Sci?entific 公司；QuickTaqHS DyeMix 購自TOYOBO 生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α 感受態細胞購自北京擎科生物科技有限公司。

1.3 引物及探針的設計、合成與特異性檢測對GenBank 中9 條BRAV 基 因 序 列 和21 條BRBV 基 因序列經MEGA7 程序比對分析后，針對BRAV 5'NTR 保守區和BRBV 3'NTR保守區分別設計特異性引物及不同熒光基團標記的探針（表1）。BRAV 的預期擴增片段為144 bp，位 于402 bp～546 bp（KT948520）；BRBV的預期擴增片段為92 bp，位于7 429 bp～7 521 bp（EU236594）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 熒光定量PCR方法的引物和探針信息Table 1 Primers and probes for real-time quantitative RT-PCR assays

1.4 重組質粒標準品的構建與鑒定以表1 中的BRAV-F/R、BRBV-F/R 引物分別對BRAV、BRBV 的核酸樣品進行PCR 擴增，將PCR 產物分別克隆至pMD19-T 載體，構建重組質粒pBRAV 和pBRBV，經PCR 鑒定后由京擎科生物科技有限公司測序鑒定。使用NanoDrop微量分光光度計測定重組質粒濃度，參照Wu等的方法計算重組質粒標準品的拷貝數[18]。

1.5 雙重熒光定量RT-PCR 反應條件的優化及標準曲線的建立采用20 μL 體系：重組質粒標準品pBRAV 和pBRBV 各0.5 μL，Premix ExTaq10 μL，BRAV-F/R、BRBV-F/R（10 μmol/μL）各1.0 μL，2 種探針（10 μmol/μL）各0.1 μL，ddH2O 補足至20 μL。分別以47 ℃、48 ℃、49 ℃、50.2 ℃、51.2 ℃、52 ℃退火，以二者擴增的Ct 值最小時的溫度為最佳退火溫度。在最佳退火溫度下，將BRAV 和BRBV 引物濃度設置為0.125 mol/L～1.000 mol/L，探針濃度設置為0.025 mol/L～0.150 mol/L，通過棋盤法優化兩種探針和引物的濃度。

以稀釋度為101～105的重組質粒標準品各0.5 μL作為模板，設置3 組平行對照，利用建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法檢測，取3 個重復組的平均值，使用R 語言計算Ct 值與拷貝數的擬合優度，并使用ggplot2 繪圖包繪制標準曲線，通過公式E=10(-1/k)-1 計算擴增效率。

1.6 特異性試驗以本實驗室保存的BRAV、BRBV、IDV、BCoV、BVDV-1、BRSV、BPIV-3 的cDNA 以及BAdV-3、牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、大腸桿菌和沙門菌的DNA 為模板，以pBRAV+pBRBV 重組質粒標準品作為陽性對照，以ddH2O 作為陰性對照，利用建立的雙重熒光定量RTPCR 方法擴增，評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗以稀釋度為100～109的重組質粒標準品pBRAV、pBRBV 各0.5 μL 作為模板，利用建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法擴增，并設立ddH2O 為陰性對照，當Ct 值≤40 時判定為陽性結果，評估該方法的敏感性。

1.8 重復性試驗批內重復性試驗：分別取稀釋度為100～105的重組質粒標準品pBRAV、pBRBV各0.5 μL作為模板，利用建立的雙重熒光定量RT-PCR 擴增，每個濃度設置3 個重復；批間重復試驗：在不同的時間相同的反應條件下對上述稀釋度的重組質粒標準品經該熒光定量RT-PCR 擴增，每種濃度設置3 個重復。通過計算批內、批間變異系數評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣品的檢測將43份BRDC病牛鼻拭子樣品每份加入5 mL PBS溶液混勻，渦旋3 min，10 000 r/min離心3 min 后取上清；以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，反轉錄為cDNA 后作為模板，以本研究建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法檢測。由于目前尚無OIE 指定的BRV 檢測方法，因此本研究采用已報道的3 種BRAV 檢測方法[10,12-13]和4 種BRBV 檢測方法[10-11,13]對上述臨床樣品進行檢測，并比較本研究所建方法與各方法的檢測結果。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品的鑒定結果構建的重組質粒標準品pBRAV 和pBRBV 經PCR 鑒定結果顯示，分別經PCR擴增出長度為144 bp和92 bp的目的片段（圖1），均與預期符合。測序結果顯示，插入的144 bp 片段與BRAV_RS3X 株（KT948520）5'NTR 基因序列的同源性為99.3%，插入的92 bp 片段與BRBV_BSRI3（KP264975）3'NTR 基因序列的同源性為100%，表明正確構建了重組質粒標準品pBRAV 和pBRBV，濃度分別為27.00 ng/μL 和79.67 ng/μL。將兩種重組質粒標準品均稀釋至1.0 ng/μL，經計算，二者的拷貝數均為3.2×109拷貝/μL。

圖1 重組質粒標準品的PCR鑒定結果Fig.1 Identification of recombinant plasmid standard by PCR

2.2 反應條件的優化及標準曲線的繪制通過棋盤法優化雙重熒光定量RT-PCR的反應體系，20 μL反應體系為：Premix ExTaq10 μL，BRAV-F/R（10 μmol/μL）各1 μL，BRBV-F/R（10 μmol/μL）各3 μL，BRAV-p、BRBV-p（均10 μmol/μL）各0.25 μL，質粒標準品各0.5 μL，補足ddH2O 至20 μL；優化后的反應程序為：95 ℃2 min；95 ℃15 s、50.2 ℃20 s，共40個循環。

線性回歸分析結果顯示，pBRAV 和pBRBV 擴增的Ct 值與其拷貝數的擬合優度均達到0.99，線性關系良好。線性方程分別為：BRAV：y=40.3-3.0x，R2=0.99；BRBV：y=42.5-3.2x，R2=0.99。擴增效率為：EBRAV=115.4%，EBRBV=105.4%（圖2）。結果表明兩種重組質粒標準品在101～105稀釋度即3.2×108拷貝/μL～3.2×104拷貝/μL濃度下均與各自的Ct 值呈良好的線性關系。

圖2 雙重熒光定量RT-PCR 檢測方法的標準曲線Fig.2 Standard curves of duplex quantitative real-time RT-PCR

2.3 特異性試驗結果特異性試驗結果顯示，本研究建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法僅特異性擴增重組質粒標準品pBRAV 和pBRBV，對IDV、BCoV、BVDV-1、BRSV、BPIV-3、BAdV-3、牛支原體、多殺性巴氏桿菌、牛溶血曼氏桿菌、大腸桿菌和沙門菌均無擴增曲線（圖3），表明本研究建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法特異性較強。

圖3 雙重熒光定量RT-PCR的特異性試驗結果Fig.3 Specificity test of duplex quantitative real-time RT-PCR assay

2.4 敏感性試驗結果以建立的雙重熒光定量RTPCR 方法對100～109（3.2×109拷貝/μL～3.2×100拷貝/μL）稀釋度重組質粒標準品進行擴增，確定該方法的敏感性。結果顯示，該方法對BRAV、BRBV 質粒標準品的檢測下限均為3.2×101拷貝/μL（圖4），表明本研究建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法敏感性較高。

圖4 BRAV（A）、BRBV（B）雙重熒光定量RT-PCR的敏感性試驗結果Fig.4 The sensitivity test of the duplex quantitative real-time RT-PCR for BRAV(A)and BRBV(B)

2.5 重復性試驗結果取稀釋度分別為100～105即3.2×109拷貝/μL～3.2×104拷貝/μL 的重組質粒標準品pBRAV、pBRBV 進行批內和批間重復性試驗。結果顯示：本研究建立的雙重熒光定量RT-PCR 檢測方法批內和批間重復性試驗Ct 值的變異系數分別為0.33%～2.46%及1.42%～3.92%，均小于5%（表2），表明該雙重熒光定量RT-PCR 方法的重復性較好。

表2 雙重熒光定量RT-PCR方法的重復性試驗結果（n=3）Table 2 Repeatability evaluation of duplex quantitative real-time RT-PCR(n=3)

2.6 臨床樣品檢測結果利用國外文獻報道的3 種BRAV 檢測方法和4 種BRBV 檢測方法以及本研究所建方法同時檢測43 份BRDC 病牛鼻拭子樣品。結果顯示，本研究建立的方法對BRAV 和BRBV 的檢出率分別為32.56%（14/43）和30.23%（13/43），二者混合感染率為22.73%（5/22），首次證實了國內牛群存在BRAV 的感染；其他3 種BRAV 檢測方法的檢出率分別為0（0/43）、2.33%（1/43）、23.26%（10/43），其他4種BRBV檢測方法的檢出率分別為27.91%（12/43）、27.91%（12/43）、27.91%（12/43）、27.91%（12/43）。本研究所建方法對BRAV 和BRBV 的檢出率均高于所有已有的檢測方法，表明該方法可以用于臨床BRV的檢測。

3 討 論

BRV 是引起BRDC 的重要病原[12,19]，由于具有2種基因型，并且2型混合感染較為普遍，如Ng等報道的美國BRDC 患牛中2 型BRV 的混合感染率為7%[10]，而現有的方法均是基于單一PCR 對2 種基因型BRV 分別檢測[10-13]。本研究分析BRV 基因序列時發現其NTR 最為保守，更適合作為檢測靶點，因此本研究針對BRAV 5'NTR 和BRBV 3'NTR 分別設計引物和探針，并經各反應條件的優化建立了同時檢測BRAV和BRBV 的雙重熒光定量RT-PCR 方法，且經試驗證明該方法特異性強、敏感性高、重復性好。

為進一步了解BRAV的分子特征并分析已報道的方法對BRDC 病牛鼻拭子樣品BRAV 檢出率低的原因，本研究從檢出的BRAV 陽性樣品中經PCR 擴增了3 個近乎全長的BRAV 基因組（MZ004694～MZ004696）（未發表），比對分析結果顯示3 種方法報道的引物均存在與擴增序列不完全匹配的現象，如Ng 等所建方法下游引物3'端的4 個堿基中有3 個堿基與參考序列的對應位點不匹配，且第4 個堿基與3 株國內BRAV相應位點堿基均不匹配[10]；Kishimoto 等報道的BRAV下游引物3'端第3 個堿基與3 株國內BRAV 參考序列對應位點的堿基均不匹配[13]，這些可能是導致這兩種方法對BRAV 檢出率低的原因。Hause 等所建方法下游引物3'端的6 個堿基中存在3 個堿基與參考序列對應位點堿基不匹配[12]，且第2 個、第6 個堿基與上述3 株國內BRAV 相應位點堿基均不匹配，可能是導致該方法未有效檢出國內BRAV 的原因。這些結果表明上述3 種方法均不適用于國內BRAV 的檢測。而本研究設計的BRAV 引物與3 株國內BRAV 相應基因序列完全匹配，且BRBV 引物3'端17 個堿基與所有BRBV 參考株相應基因序列均匹配，因此建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法擴增效率及敏感性均較高。該方法使用不同熒光基團修飾的探針，可以同時檢測兩型BRV，特異性較強，并且可在1 h 左右完成檢測，與恒溫熱隔絕式RT-PCR 用時相近[20]，為BRV 提供了快捷的檢測手段。上述結果提示，進一步加強國內BRV 流行株的分子特征研究將有助于BRV 檢測方法的優化和完善。

近年來，國內肉牛養殖業發展迅速，呼吸道疾病對養牛業危害大，已成為影響肉牛養殖業經濟效益的重要原因[21]。然而國內對BRDC 的研究較晚，且其流行病學資料較少，雖已證實牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、BPIV-3、BCoV、BVDV 等是BRDC 的重要病原[22]，但對致BRDC 的BRV 還知之甚少。最近Xie 等報道了BRBV 在國內的存在[11]，但目前國內尚無BRAV 的相關報道。本研究利用建立的雙重熒光定量RT-PCR 方法檢測四川、河北和吉林省4 個不同地區的43份BRDC病牛鼻拭子樣品，并與已報道的3 種BRAV 及4 種BRBV 的熒光定量RT-PCR 方法進行了比較。結果顯示，本研究建立方法對BRV的檢出率為51.16%（22/43），其中BRAV 和BRBV 的檢出率分別為32.56%（14/43）和30.23%（13/43），均高于所有已報道的BRV檢測方法。也表明BRV是BRDC的重要病原，并首次證實BRAV 在國內的存在，豐富了BRV 的分子流行病學資料。值得注意的是，在22份BRV陽性樣品中，5份樣品存在BRAV和BRBV的混合感染，感染率為22.73%（5/22），該現象與Ng 等在加利福尼亞州報道的結果相近[10]，進一步表明建立檢測BRAV 和BRBV 雙重熒光定量RT-PCR 方法的必要性。

綜上所述，本研究建立了同時檢測BRAV 和BRBV 的雙重熒光定量RT-PCR 方法，該方法具有特異性強、敏感性高、穩定性和重復性好的特點，為BRV 的檢測提供了新的檢測手段，并首次證實國內牛群中存在BRAV 的感染，且還有BRAV 和BRBV 混合感染的現象，為國內BRDC 的防控提供了新的參考依據。