2020年～2021年我國副豬嗜血桿菌和鏈球菌的血清型、耐藥基因型流行情況分析

董婉玉，王馨雨，張聚民，王晴雨，肖 敏，任 華，盧 昌，周瑩珊，杜 靜，于浩然，仲 偉，宋厚輝*，王曉杜*

（1.浙江農林大學動物科技學院/動物醫學院/浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室/動物健康互聯網檢測技術浙江省工程研究中心/浙江省動物醫學與健康管理國際科技合作基地/中澳動物健康大數據分析聯合實驗室，浙江 杭州 311300；2.杭州市臨安區畜牧農機發展中心，浙江 杭州 311300；3.江西正邦農業科學院，江西 南昌 330096）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）[1]和豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）[2]是豬場最常見的細菌性疾病病原，嚴重危害保育豬的健康，主要導致豬的多發性漿膜炎、腦膜炎、關節炎、心內膜炎、敗血癥、支氣管炎等[3-4]，常伴隨豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2 型等病毒感染后期的繼發感染[5]，給養豬業造成重大經濟損失。

HPS 是一種兼性厭氧的革蘭陰性菌，依據其莢膜多糖基因的不同[6]，利用分子生物學技術可以將其分為1～15 個血清型[7]，其中優勢血清型包括：血清2、4、5、12、13 型等； SS 是一種有莢膜的革蘭陽性球菌，由于莢膜多糖基因的差異[8]，利用PCR 技術 可 以 將 其 分 為1～34 和1/2 共35 種 血 清 型[9]，2014年之前優勢血清型包括：2、3、7、8、9、28、29型。HPS 和SS 不同血清型之間的抗原交叉保護性均較弱，不能僅利用某一血清型疫苗做到有效防控HPS 或SS 的感染。因此，臨床上常用抗生素治療和預防性給藥，常見獸用抗生素包括β-內酰胺類、氨基糖類、四環素類、大環內酯類、喹諾酮類、甲氧芐啶類、磺胺類和其他抗菌藥物，但長期預防性給藥易導致細菌耐藥性的增強[10-11]。細菌耐藥性是由其耐藥基因編碼的酶所決定，細菌長期在抗生素的壓力下，其耐藥基因不斷突變、耐藥基因轉導等原因，導致多重耐藥菌株不斷出現，給養殖場臨床用藥造成較大困難。

因此，本研究采用PCR 方法檢測2020 年～2021年分離自國內10 個省份的HPS 和SS 分離株的血清型和耐藥基因，采用藥敏試驗檢測二者的耐藥性，并將檢測結果與2014 年～2020 年的相應檢索結果比較分析，以期為規?；B殖場HPS 和SS 的血清型和耐藥基因的研究和相關疾病的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 分離菌株52株HPS和69株SS由浙江農林大學動物預防醫學與公共衛生實驗室分離自2020年～2021年國內浙江、江西、湖北、湖南、廣東、廣西、云南、新疆、遼寧、江蘇10 個省的規?；B殖場不同發病仔豬的肺臟，且同一個養殖場均分離到了HPS和SS（表1）。分離純化的各菌株均于-80 ℃保存。

表1 52株HPS和69株SS信息Table 1 Information on 52 isolates HPS and 69 isolates of SS

1.2 主要試劑NAD 輔酶和大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自Thermo Scientific（中國）有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自廣東環凱為神武科技有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司；KOD plus Neo購自日本東洋紡生物有限公司；PCR Mix 和細菌基因組DNA 小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 HPS 和SS 分離菌血清型的PCR 鑒定提取HPS 分離株基因組DNA 作為模板，采用文獻[12]中PCR 方法檢測分離HPS 的血清型；提取SS 分離菌株基因組DNA 作為模板，采用文獻[9]中PCR 方法檢測分離SS 的血清型。

1.4 HPS 和SS 的藥敏試驗采用WHO 推薦的Kir?by-Bauer（K-B）紙片擴散法分別檢測HPS 和SS 對臨床常用9 類（β-內酰胺類、大環內酯類、氨基糖苷類、四環素類、喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類、多肽類、林可酰胺類）共計30 種藥物的敏感性。

1.5 HPS 和SS 常見耐藥基因的PCR 鑒定參照文獻[13]，由北京擎科生物科技有限公司合成細菌常見耐藥基因引物。分別以1.3 提取的HPS 和SS 基因組DNA 為模板， 經PCR 擴增β-內酰胺類（bla-TEM、bla-OXA、bla-CTX、bla-SHV、bla-IMP、bla-DHA）、氨基糖苷類（aad-AI、aad-A2、strA、strB、aadB、aacC、Aph（3'）-Ia）、四環素類（tetA、tetB、tetD）、喹諾酮類（gyrA、parC）、甲氧芐啶類（dhfrV、dhfrVII、dhfrXII、dh?frXIII）、磺胺類（SulI、SulII）和I 型整合子（3'CS、Int1、VR）等7 大類共27 種耐藥基因。

1.6 部分分離菌株耐藥表型與耐藥基因相關性的分析選取10 個省11 株HPS 和14 株SS 臨床分離株進行耐藥基因（β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、喹諾酮類和磺胺類）與其耐藥表型的相關性分析。耐藥基因型與耐藥表型符合率=（攜帶耐藥基因并具有相應耐藥表型的菌株數+不攜帶耐藥基因且不具有相應耐藥表型的菌株數）/總菌株數*100%。

1.7 本研究分離的HPS 和SS 與國內已分離HPS 和SS 血清型的比較分析檢索2014 年～2020 年國內外發表的402 株HPS[14-17]和189 株SS[9,18]的血清型數據（表2），結合本研究的檢測結果，利用Graphad Prism7.0 軟件統計分析2014 年～2020 年我國HPS 和SS優勢血清型的流行趨勢。

表2 2014年～2020年發表文獻的HPS和SS的血清型統計結果Table 2 Statistical results of reported HPS and SS serotypes in 2014-2020

2 結 果

2.1 HPS 分離株血清型的PCR 鑒定及其與文獻發表HPS 血清型的比較分析結果利用PCR 方法對52株HPS 進行血清型鑒定并經統計分析，結果顯示，優勢血清型為為4、5、12、13 型，分別各占15.38%（8/52）、15.38%（8/52）、30.76%（16/52）、11.54%（6/52）（圖1）。國內外文獻報道2014 年～2020 年的402 株HPS中，優勢血清型分別為4、5、7、13、14 型、不確定型（Undetermined serotype，US）分別各占25.90%（104/402）、 24.90%（100/402）、 6.70%（27/402）、8.95%（36/402）、7.50%（30/402）、11.94%（48/402）（圖1）。結果表明，血清4、5、13 型仍是HPS 的優勢血清型，可以作為臨床HPS 滅活疫苗的候選株；與2014 年～2020 年文獻報道的相比，2020 年～2021 年HPS 優勢血清型中的12 型的流行率較高，且升高了28%，值得重點關注。

圖1 本研究分離及文獻報道的HPS血清型的統計結果Fig.1 Serotypes analysis of HPS isolated in this study and reported in the literature

2.2 SS 分離株血清型的PCR 鑒定及其與文獻發表SS 血清型的比較分析結果利用PCR 方法檢測66 株SS 分離株的血清型。結果顯示，主其要優勢血清型為2 或1/2、5、8、15、18、27 和US，分 別 占23.18%（16/69）、17.39%（12/69）、10.14%（7/69）、7.24%（5/69）、10.14%（7/69）、8.69%（6/69）、11.65%（8/69）（圖2）。國內外文獻報道2014 年～2020 年我國SS 流行的優勢血清型分別為2 或1/2、7、9 和US，分別占22.75%（43/189）、13.75%（26/189）、9.52%（18/189）、5.29%（10/189）（圖2）。結果表明，2 或1/2 仍然是我國SS的優勢血清型；相比2014 年～2020 年的文獻報道，2020 年～2021 年SS 優勢血清型發生了變化，5、15、18、27 型明顯增加，7 和9 型減少；US 仍較多，是否將其確定為新型需要進一步研究。

圖2 本研究分離及文獻報道的SS血清型統計分析Fig.2 Serotype analysis of SS isolated in this study and reported in the literature

2.3 HPS 和SS 分離株的藥敏試驗結果藥敏試驗結果顯示，兩類分離菌中對β-內酰胺類（β-lac?tams）、大環內酯類（Macrolides）和磺胺類（Sulfon?amides）藥物耐藥高達88.31%（68/77），對氨基糖苷類（Aminoglycosides）和四環素類（Tetracyclines）耐藥的分離株相對較高，分別為80.52%（62/77）和76.62%（59/77）。對酰胺醇類（Amide alcohols）和喹諾酮類（Quinolones）藥物有一定程度的耐藥，耐藥菌株分別為11.69%（9/77）和32.47%（25/77）（圖3A）。采用Graph?pad 軟件分析HPS 和SS 分離株的多重耐藥性。結果顯示，HPS和SS臨床分離株存在嚴重的多重耐藥性，其中雙重耐藥的菌株占比最高（28.57%，22/77），分離菌株最多可同時耐8 種藥物。其中4 重、5 重、6 重及8重耐藥的菌株均為14.29%（11/77）（圖3B）。上述結果表明，HPS 和SS 均存在同一菌株多重耐藥現象，其中對β-內酰胺類、大環內酯類和磺胺類藥物耐藥的菌株最高。建議在臨床上通過細菌體外分離培養與鑒定病原后，結合藥敏試驗結果有針對性的使用抗菌藥物。

圖3 HPS和SS分離株的藥敏試驗（A）及多重耐藥分析（B）Fig.3 Antimicrobial susceptibility(A)and multidrug resistance analysis(B)of HPS and SS isolates

2.4 HPS 和SS 分離株耐藥基因的檢測結果利用PCR 分別擴增HPS 和SS 分離株7 大類27 種耐藥基因，結果顯示，兩類分離菌均100%檢出β-內酰胺類的bla-TEM和磺胺類的sulI耐藥基因；100%HPS 分離株檢出氨基糖苷類的Aph（3'）-Ia、I 類整合子的3'CS和Int1耐藥基因；超過50%的HPS 分離株檢出氨基糖苷類的strB和磺胺類的sulII耐藥基因。100%SS 分離株檢出I 類整合子的VR耐藥基因；約50%的SS 分別檢出I 類整合子的3'CS和Int1耐藥基因，且均為不同菌株中檢出該兩種基因，其他耐藥基因均未在兩類分離菌中檢出（圖4）。雖二者均未檢測到喹諾酮類和四環素類耐藥基因，但二者的部分分離菌株卻對這兩類藥物中的氧氟沙星、環丙沙星、加替沙星、四環素、米諾環素耐藥。且在HPS 和SS 中均存在同一菌株攜帶不同類型耐藥基因的現象，再次表明這兩類細菌均存在多重耐藥現象；β-內酰胺類和磺胺類藥物耐藥基因檢出率高，表明臨床針對這兩類藥物耐藥嚴重，需科學合理用藥。

圖4 HPS和SS耐藥基因的檢測結果Fig.4 Detection of drug resistance genes in HPS and SS isolates

2.5 HPS 和SS 分離株耐藥表型和耐藥基因相關性的分析本研究分別選取10 個地區共約25%的HPS和SS 分離株，分析二者耐藥表型和耐藥基因的相關性。結果顯示，β-內酰胺類和磺胺類耐藥表型與其耐藥基因之間的符合率最高，均為88%；氨基糖苷類耐藥表型與其耐藥基因之間的符合率為72%；其他耐藥基因和耐藥表型之間不符合（表3）。表明HPS和SS 分離株對β-內酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類藥物的耐藥性，可能是由其攜帶的耐藥基因導致；但二者對四環素類和喹諾酮類藥物的耐藥性可能還存在其他的耐藥機制。

表3 部分HPS和SS分離株耐藥表型和耐藥基因相關性的分析結果Table 3 Analysis of correlation between of drug resistance phenotype and genotype of partly HPS and SS isolates

3 討 論

自從2018 年我國暴發非洲豬瘟后，我國養豬產業人員的生物安全意識和水平得到極大了提升，疫病防控水平明顯提高[19]，但隨著國家推行抗生素減量化行動，豬場飼料禁止添加抗生素，導致豬場細菌類疾病發病率上升，致保育豬和中大育肥豬死亡率明顯升高。而導致中大豬死亡的細菌類病原主要為HPS 和SS 等，因此針對該類病原感染的防控是目前的熱點之一。

HPS 15 個血清型可以被劃分為：高毒力型為1、5、10、12、13、14 型；中等毒力型為2、4、8、15型；3、6、7、9、11 型為無毒力型。國外流行的HPS 優勢血清型主要為1、2、4、5、12、13 型[20-22]，2007 年～2014 年我國HPS 的優勢血清型為2、4、5、12、13 型等[7]，2014 年～2020 年為4、5、7、13、14型和US[14]，7 型作為無毒力型，也能從發病豬中分離到，間接說明HPS 可能是一種條件致病菌[23]。本研究結果顯示，2020 年～2021 年HPS 的優勢血清型為4、5、12、13 型，特別是12 型的再次出現，值得關注。

SS 作為豬上呼吸道的常在菌，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2 型、豬流感病毒等混合感染，導致豬的發病率和死亡率明顯升高[24]。研究表明，雖然血清型不是SS 致病性的唯一因素[25]，但是血清2 型、9 型SS 仍是導致歐洲和美國豬發病的優勢血清型[26]；2014 年之前我國流行的SS 優勢血清型為2、3、7、8、9、28、29 型[9]，而2014 年～2020 年則為2 或1/2、7、8、9 和US 型[9,18]，比國外更加復雜。隨著我國非洲豬瘟區域防控措施的實行及豬引種和流動的變化，2020 年～2021 年我國SS 優勢血 清 型 為2 或1/2、5、8、15、18、27 和US，5、15、18、27 型的流行率升高。

研發流行優勢血清型的細菌多聯多價疫苗是防控HPS 和SS 感染的有效措施，尤其是針對懷孕母豬開展優勢血清型細菌疫苗的免疫，將有效降低HPS和SS 感染的發病率。然而，豬場仍主要以抗生素防治HPS 和SS 的感染，導致抗生素濫用現象嚴重，細菌耐藥性逐年增加，特別是多重耐藥菌株的出現，致豬場能用的抗生素種類逐步減少。本研究藥敏試驗統計結果表明，HPS和SS中均存在多重耐藥現象，對β-內酰胺類、大環內酯類和磺胺類藥物耐藥的菌株占比最高。Zhao 等的研究結果顯示，75%以上的HPS 存在耐藥性，對萘啶酸耐藥的菌株占比達82.52%，相關耐藥基因的檢出率達100%，其中bla-TEM-1、bla-ROB-1、ermB、ermA、flor、catl、tetB、tetC、rmtB、rmtD、aadA1、aac（3'）-llc、sulI、sulII等14 種耐藥基因均被檢出[11]，而本研究的兩類細菌中耐藥基因bla-TEM和sulI均100%檢出。SS 則對3 種及以上抗生素耐藥[10]，耐藥基因ermB和tetO與其對林可酰胺、大環內酯和四環素類藥物的耐藥性密切相關；耐 藥 基 因aad（6）、ant（6）-Ia、ermB、tetO、patB、sat4、aph（3'）-IIIa、aac（6'）-Ie-aph（2''）-Ia與其對氨基糖苷類、大環內酯類和氟喹諾酮藥物的耐藥性相關[27]。本研究結果顯示，100%的HPS 分離株均檢出耐藥基因Aph（3'）-Ia、3'CS、Int1，超過50%的HPS 檢出耐藥基因strB和sulII，其中磺胺類耐藥基因檢出結果與上述研究結果相似，其他耐藥基因檢出結果有差異可能是由于細菌對某種或者某幾種藥物耐藥導致養殖場應使用了新藥，從而誘發產生了新的耐藥基因；100%的SS 檢出耐藥基因VR，約50%的SS 分別檢出耐藥基因3'CS和Int1。與上述研究結果不同，可能是由于SS 分離株來源于不同的養殖場，而不同養殖場的用藥背景有差異所致。

通過對部分分離株耐藥基因和耐藥表型的相關性分析顯示，兩類細菌對四環素類和喹諾酮類藥物的耐藥基因和耐藥表型之間的符合率較低，其原因可能是菌株存在未檢測的耐藥基因；而兩類細菌對β-內酰胺類、磺胺類和氨基糖苷類藥物的耐藥表型與耐藥基因型之間的符合率較高，表明，這些菌株的耐藥表型可能主要是由這些耐藥基因所介導。本研究結果還顯示，有些菌株攜帶相關耐藥基因，但卻未表現出對應的耐藥表型，推測可能是這些菌株的耐藥基因處于沉默狀態需要在許多不同的遺傳因素刺激下才會表達[28]；而一些菌株雖表現出相應耐藥表型卻并未檢測到對應的耐藥基因，推測該菌株的耐藥性可能并非由該基因決定，或許還存在其他未檢測的耐藥基因及其他導致該耐藥表型的耐藥機制。

綜上所述，本研究分析了2020 年～2022 年我國HPS 和SS 的流行優勢血清型，檢測了二者的耐藥表型及相關耐藥基因，并證明其部分耐藥表型與其攜帶的耐藥基因呈較強的相關性。為規?；B殖場HPS 和SS 耐藥基因變化規律的研究、臨床用藥以及疫苗的研發提供參考。