鴿I型腺病毒SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立

楊俊杰，韓曉語，劉春羽，王亞新，郭 昊，溫永俊，王鳳雪

（內蒙古農業大學獸醫學院，農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

禽腺病毒（FAdV）無囊膜、直徑70 nm～90 nm、病毒粒子呈二十面體對稱、基因組為雙股DNA，主要的結構蛋白是六鄰體蛋白（Hexon）和纖維蛋白（Fi?ber）[1]。FAdV 屬共分為14 個種：禽腺病毒A～E 種、鴨腺病毒B、鴿腺病毒A（PIAdV-A）、鴿腺病毒B、鵝腺病毒A、火雞腺病毒B～D 種、鸚鵡腺病毒B 種和獵鷹腺病毒B 種[2]。PIAdV-A 在國際病毒分類委員會（ICTV）的第九次報告中被建議設立為FAdV 屬中的一個新物種[3]。鴿子感染PIAdV 后可分為I 型（也稱為經典腺病毒、鴿I 型腺病毒或PIAdV-I 型）和II型（也稱為鴿子II 型腺病毒或PIAdV-II 型），值得注意的是Ⅰ型和II 型的區分依據并不是某種病毒株或病毒抗原表位的差異，而是依據引起的臨床癥狀和病變的不同[4]。PIAdV-I 感染后主要表現為嘔吐、腹瀉和大約一周的持續性體重減輕，PIAdV-II 感染后以廣泛的肝壞死和突然死亡為特征[5]。目前PIAdV 一些分離株尚不能被定性分類，因為它們既不能與鵝的3 個腺病毒I 型抗血清發生反應，又不能與雞的腺病毒陽性血清發生反應，但是通過群特異性反應可以被證實為PIAdV-I。PIAdV-I 的感染在臨床上難以診斷、防制困難，所以建立早期快速特異性檢測方法對有效防控該病具有重要意義[6]。

目前世界動物衛生組織（OIE）對PIAdV-I 尚無推薦的檢測方法，因此對其的檢測主要為病毒分離鑒定、免疫染色和電鏡觀察等，但是這些技術存在耗時長，過程復雜或缺乏一定特異性等弊端[7]。PIAdV的分離比較困難，因此通過該病毒的分離鑒定也不是常規檢測手段，目前文獻報道PIAdV 僅成功分離10 株[8]。SYBR Green I 熒光定量PCR（qPCR）檢測方法具有操作方便、迅速、可視化等優點，相較于普通PCR 檢測具有更高的靈敏性且無需進行核酸凝膠電泳分析步驟，還可規避開蓋后造成的交叉污染風險。Raue 等以PIAdV-I IDA4（FN824512.2）株高度保守的Fiber 2 為靶基因建立了能夠特異性檢測到PIAdV-I 且不會與其他FAdV 發生交叉反應的普通PCR 方法，可直接用于組織樣品中PIAdV-I 的檢測[9]。因此，本研究擬在Raue 等的研究基礎上，利用其設計的PIAdV-I Fiber 2 基因檢測引物構建重組質粒標準品，并設計一對針對Fiber 2 基因的特異性qPCR 引物，建立一種快速檢測PIAdV-I 的qPCR 方法，為PIAdV-I 感染的防控提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 基因組和臨床樣品PIAdV-I、鴿圓環病毒（PICV）、新城疫病毒（NDV）、多殺性巴氏桿菌（PM）、禽致病性大腸桿菌（APEC）共5 種病原基因組均由本實驗室于-80 ℃保存；PIAdV-II Fiber 2基因保守區標準陽性質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；30 份病死鴿肝臟樣品采集于呼和浩特市某賽鴿公棚，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑GoTaq?qPCR Master Mix 和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；血液/細胞/組織DNA 基因組提取試劑盒購自天根生化（北京）科技有限公司；LATaqDNA 聚合酶購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；Trans T1 感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit 購自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA 連接酶購自NEB（北京）有限公司。

1.3 引物設計與合成參考Raue 等針對PIAdV-I Fiber 2 基因保守區設計的一對特異性引物Fiber-F：ATCAACTACGACAACGAAGGC/Fiber-R：CGGTAGAG TTACGGGGAAATT，預期擴增片段967 bp[9]。利用Primer 5.0 軟件設計SYBR Green I qPCR 特異性引物Fiber-q-F：ATTGGGAGTACGACTACGG/Fiber-q-R：GGAATGGGATCGGAGGTCTGTA， 預 期 擴 增 片 段174 bp。以上引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 重組質粒標準品的構建與鑒定以PIAdV-I 基因組DNA 為模板，利用引物Fiber-F/Fiber-R PCR 擴增目的基因片段，并克隆于pMD19-T 載體構建重組質粒pMD19-Fiber，并經測序和序列比對鑒定正確后，利用紫外分光光度計測定重組質粒的濃度，根據公式計算拷貝數后作為重組質粒標準品，-20 ℃保存備用。

1.5 反應條件的優化及標準曲線的繪制按GoTaq?qPCR Master Mix 試劑盒說明書對qPCR 20 μL 反應體系中的上下游引物（10 μmol/L）體積（0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL）進行優化，得到最佳反應體系；對退火溫度（56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃）進行優化，得到最佳反應條件。將重組質粒標準品稀釋為1×1010拷貝/μL 再進行10 倍倍比稀釋（1×108拷貝/μL～1×103拷貝/μL）后作為模板，按照優化后的qPCR 反應條件擴增，繪制標準曲線和溶解曲線。

1.6 特異性試驗利用建立的qPCR 方法對1.1 中列出的5 種病原基因組及PIAdV-II Fiber 2 基因保守區標準陽性質粒樣品進行擴增，并設立陰性對照（ddH2O），評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗將重組質粒標準品10 倍倍比稀釋（1×108拷貝/μL～1×100拷貝/μL）后分別作為模板，利用建立的qPCR 檢測方法和Raue 等建立的PIAdV-I 普通PCR 檢測方法[9]分別擴增，對比兩種方法檢測結果，評估該方法的敏感性。

1.8 重復性試驗批內重復性試驗：將重組質粒標準品10倍倍比稀釋（1×109拷貝/μL～1×105拷貝/μL），每個樣品設3 個重復，進行qPCR 的擴增，根據Ct 值計算標準差和變異系數評估該方法的批內重復性。利用建立的qPCR 對上述各稀釋度的重組質粒標準品在不同的時間qPCR 擴增，進行批間重復性試驗，每個樣品重復3 次，根據Ct 值計算標準差和變異系數，評估該方法的批間重復性。

1.9 臨床樣品的檢測取30 份病死鴿肝臟樣品，分別研磨后離心，取上清，利用試劑盒提取基因組DNA 并作為模板，利用建立的qPCR 方法和Raue 等建立的PIAdV-I 普通PCR 方法[9]分別檢測，比較二者的檢測結果，并計算二者的符合率。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品的鑒定結果測序和序列比對結果顯示，克隆至pMD19-T的基因序列與目的基因序列相同，表明正確構建了重組質粒pMD19-Fiber。經計算濃度為6.31×1010拷貝/μL。

2.2 qPCR 反應條件的優化及標準曲線的建立通過反應體系和反應條件的優化，確定20 μL 最佳反應體系：Nuclease-Free Water 7.6 μL，2×GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL，CXR Reference Dye 0.2 μL，Fiberq-F（10 μmol/L）0.6 μL，Fiber-q-R（10 μmol/L）0.6 μL，DNA 模板1 μL。最佳反應條件：95 ℃2 min；95 ℃15 s、60 ℃30 s，40 個循環；95 ℃15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s。在最佳反應體系和反應條件下，對濃度分別為1×103拷貝/μL～1×108拷貝/μL 的重組質粒標準品pMD19-Fiber 進行檢測，建立標準曲線（圖1）。標準曲線顯示，質粒標準品濃度在1×103拷貝/μL～1×108拷貝/μL 時與Ct 值有良好的線性關系，標準曲線Y=-3.587x+48.275，相關系數R2=0.995，擴增效率為90%。溶解曲線顯示，各濃度標準品均出現窄且尖的特異性單峰（圖2），表明無引物二聚體和非特性擴增，其溶解溫度為85.0 ℃±0.5 ℃。

圖1 qPCR方法標準曲線的建立Fig.1 Standard curve of qPCR

圖2 qPCR方法的熔解曲線Fig.2 Melting curve of qPCR

2.3 特異性試驗結果利用建立的qPCR 對6 個樣品進行檢測，結果顯示僅PIAdV-I 檢測為陽性，其他5 種病原和陰性對照檢測均為陰性（圖3），表明該方法特異性較強。

圖3 qPCR的特異性試驗結果Fig.3 Specificity test of fluorescence quantitative PCR

2.4 敏感性試驗結果利用建立的qPCR 方法和普通PCR方法[9]分別對濃度為1×100拷貝/μL～1×108拷貝/μL的重組質粒標準品pMD19-Fiber 進行檢測。結果顯示，qPCR 對pMD19-Fiber 的最低檢出限為1×102拷貝/μL（圖4A），而普通PCR 對pMD19-Fiber 的最低檢出限為1×104拷貝/μL（圖4B）。表明該qPCR 方法的敏感性較高。

圖4 PIAdV-I qPCR（A）和普通PCR（B）敏感性試驗結果Fig.4 Sensitivity test results of PIAdV-I qPCR(A)and routine PCR(B)

2.5 重復性試驗結果利用建立的qPCR 方法對濃度為1×105拷貝/μL～1×109拷貝/μL 的pMD19-Fiber 進行批內和批間重復性試驗。結果顯示，批內變異系數小于1%，批間變異系數小于2%（表1），表明該方法重復性較好。

表1 重復性試驗結果Table 1 Intra-and inter-assay reproducibility

2.6 臨床樣品的檢測結果利用建立的qPCR 方法和Raue 等建立的PIAdV-I 普通PCR 方法[9]分別對采集的30份鴿肝臟樣品檢測。結果顯示，普通PCR方法陽性檢出率為36.7%（11/30）；qPCR 方法陽性檢出率為63.3%（19/30），且普通PCR 鑒定為陽性的樣品qPCR檢測的結果也均為陽性。兩種方法的陽性符合率為100%，陰性符合率為57.89%，總符合率為73.30%，qPCR 方法陽性檢出率明顯高于普通PCR 檢測方法，表明該qPCR 方法可以用于臨床樣品的檢測。

3 討 論

PIAdV-I 作為一種接觸性傳染病病原，傳播范圍廣、發病率高，尤其對賽鴿，由于訓放過程中處于高度應激狀態，因免疫抑制從而成為易感動物[9]。20世紀70 年代就已經診斷出PIAdV-I 感染的散在病例，但直到1984 年Cousement 才首次在比利時發現只感染鴿的病原—PIAdV-I[10]。在此之后PIAdV-I 感染已不只局限在某一區域，而是在全世界范圍內開始傳播并被廣泛報道[11]。該病雖病死率不高但極易與其他細菌或病毒等混合感染，造成鴿子的大量死亡，給鴿產業造成嚴重經濟損失。我國對PIAdV-I的研究較少，對該病的發病機制，流行病學調查等也尚不明確。隨著分子生物學技術的廣泛應用，qPCR已應用于多種病毒性疾病的檢測。與常規PCR 相比，SYBR Green I qPCR 檢測方法具有簡便、快速、靈敏、高效等特點，并可以對病毒定量檢測[12]。

PIAdV-I 的分離費時費力，且難度極大；同時國內外文獻對PIAdV-I 檢測方法的研究報道極少，OIE 也無相關推薦檢測方法，因此為了評估本研究建立的檢測方法，本研究將建立的PIAdV- I SYBR Green I qPCR 檢測方法和參考文獻[9]中Raue 等建立的PIAdV-I 普通PCR 檢測方法進行對比，兩種檢測方法對病毒的最低檢測限分別為100拷貝/μL、1×104拷貝/μL。通過兩種方法的最低檢測限的比較發現，本實驗建立的SYBR Green I qPCR 方法比普通PCR 具有更高的陽性檢出率（63.3%），普通PCR 陽性檢測率僅為36.7%，同時符合率也證實該方法的可靠性。因此，通過與現有的成熟的檢測方法比較后發現，SYBR Green I qPCR 方法在兼具經濟性和靈敏性的優勢，能更好地在臨床檢測中進行推廣。

本實驗建立的SYBR Green I qPCR 檢測方法為PIAdV-I的快速、特異、經濟的臨床檢測提供了有力的技術支持，也對PIAdV-I 的流行病學調查及進一步研究奠定一定基礎。