B亞型禽偏肺病毒對商品肉雞的致病性研究

馮笑艷，包媛玲，于蒙蒙，孟令宅，劉 鵬，王素艷，李欣翼，張 卓，張艷萍，劉長軍，王笑梅,2，高玉龍*

（1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.揚州大學江蘇動物重要疫病與人畜共患病協同創新中心，江蘇 揚州 225009）

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV）屬于副黏病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬成員[1]。aMPV于1978 年首次在南非被發現并報道，隨后在全球范圍內流行。根據編碼G 基因的核苷酸序列差異和血清中和交叉反應，將aMPV 分為A、B、C 和D 等4 個亞型[2]，其中A和B亞型aMPV 流行范圍廣，世界多地均有報道，C 亞型aMPV 在美國、韓國、加拿大、中國等地有報道，D亞型僅在法國被檢測到[3]。

aMPV 的自然宿主是雞和火雞，其次是鴨、鵝及野生遷徙鳥類。aMPV 感染火雞引起火雞的鼻氣管炎（Turkey rhinotracheitis，TRT）；感染蛋雞導致產蛋量下降，軟殼蛋和薄殼蛋增多，若伴有上呼吸道癥狀時會引起母雞子宮脫落；感染肉雞則引起腫頭綜合征（Swollen head syndrome，SHS），主要表現為：泡沫性結膜炎、流涕、流淚、下頜水腫和眶下竇腫脹[4]；感染野生鳥類臨床癥狀不明顯，但其可充當宿主攜帶并傳播病毒[5]。aMPV 單一感染死亡率較低，但若與新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒或細菌發生混合感染，將加重病情導致較高的死亡率。另外，aMPV感染會引起蛋雞產蛋率、孵化率等生產性能下降及肉雞肉質、增重比及飼料轉化率等關鍵生長性能指標下降[6]，造成嚴重的經濟損失。

我國首次于1998年報道了aMPV，隨后的血清學調查和病原學調查結果顯示，黑龍江、吉林、新疆、湖北、河北等多地肉雞中普遍存在B 亞型aMPV 的感染，且流行范圍越來越廣[7-8]。但關于B 亞型aMPV 對肉雞的致病性研究鮮有報道，本研究將本實驗室前期分離的B 亞型aMPV LN16 株[9]通過滴鼻的方式接種21日齡的商品肉雞，系統分析了B 亞型aMPV 對肉雞的致病性，為養殖場aMPV病的診斷及防控提供指導。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料B 亞型aMPV LN16 株由本實驗室分離、鑒定并保存[9]。Vero細胞由本實驗室保存。1日齡商品肉雞購自國內某商品肉雞場。RNAiso plus、10×PCR Buffer（Mg2+Plus）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）TaKaRaTaqTMHot Start 均購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉錄試劑HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR購自南京諾唯贊有限公司；aMPV 抗體檢測試劑盒為美國IDEXX公司產品。

1.2 引物、探針的設計與合成參考文獻[9,10]B亞型aMPV LN16 株序列，設計熒光定量RT-PCR 引物及探針，其中熒光定量RT-PCR 引物由吉林庫美生物科技有限公司合成，特異性TAMRA 標記的B 亞型aMPV探針由金斯瑞生物科技股份有限公司合成（表1）。

表1 B亞型aMPV熒光定量RT-PCR檢測引物Table 1 B subtype aMPV qRT-PCR detection primers

1.3 肉雞的分組、感染與臨床癥狀的觀察將24 只21 日齡肉雞（母源抗體檢測均為陰性）隨機均分為感染組和空白組，感染組采用滴鼻的方式接種5×103TCID50/只（200 μL）LN16 株病毒液，空白組不做處理，分別飼養于不同的負壓隔離器內，在7 d 的觀察期內觀察記錄感染組和空白組雞臨床癥狀，并于感染后1 d～7 d內每日采集鼻腔拭子。

1.4 肉雞排毒的熒光定量PCR 檢測將采集的鼻腔拭子于600 μL 無菌PBS 震蕩混勻20 s，4 ℃300×g 離心5 min，取200 μL 上清采用TRIzol 法提取RNA，采用反轉錄試劑盒制備cDNA，以其為模板，采用文獻[10]中熒光定量RT-PCR 檢測感染肉雞排毒情況，并計算樣品中病毒拷貝數。

1.5 病毒在肉雞各組織分布的熒光定量PCR 檢測感染后第4 d 于感染組和空白組中分別隨機取3 只雞，心臟采血后取鼻甲骨、肺臟、氣管、哈氏腺各0.1 g，研磨后采用TRIzol 法提取RNA，采用熒光定量RT-PCR[10]檢測病毒在肉雞各組織的分布情況。

1.6 肉雞血清抗體的檢測感染后1 d～21 d，每經7 d 翅下采集各組肉雞的非抗凝血，分離血清，利用aMPV 抗體ELISA 檢測試劑盒檢測各組雞血清抗體變化情況。

1.7 肉雞各組織病理學檢測感染后第9 d，感染組和空白組各隨機剖殺2 只雞，取鼻甲骨、肺臟和氣管于10%福爾馬林內固定、常規方法包埋、制作石蠟切片、HE 染色后鏡檢觀察各組織病理學變化。

1.8 數據的統計與分析實驗數據利用GraphPad Prism 8 進行分析處理并作圖。

2 結 果

2.1 肉雞臨床癥狀觀察結果感染后1 d～7 d 每天觀察各組雞的臨床癥狀，可見感染組雞在感染后第3 d 開始出現流鼻涕、眼睛有泡沫等癥狀，從第4 d開始出現泡沫狀和粘稠狀鼻涕，第6 d 感染組雞的發病率最高，癥狀也最明顯，第6 d 和7 d 各有1 只雞出現了鼻痂的癥狀；空白組雞在觀察期未見任何臨床癥狀。感染組雞感染后3 d～6 d 發病率逐漸升高，由33.3%（4/12）上升至83.3%（10/12），第7 d 開始降低，感染組累計發病率為100%（12/12）；空白組雞無發病。表明商品肉雞感染B 亞型aMPV 會出現明顯的臨床癥狀。

2.2 肉雞排毒檢測結果感染后1 d～7 d 每日采集感染組與空白組肉雞的鼻腔拭子，利用熒光定量RTPCR 進行排毒檢測，結果顯示，感染組雞在感染后1 d～3 d 鼻腔拭子中病毒拷貝數呈上升趨勢，第3 d 達峰值（6.31×104拷貝/200 μL）后開始下降，并持續至第6 d，第7 d 檢測不到排毒；空白組雞未檢測到排毒（圖1）。表明商品肉雞感染B 亞型aMPV 后排毒持續期為6 d，排毒高峰在感染后第3 d。

圖1 排毒檢測結果Fig.1 Viral shedding results

2.3 病毒在肉雞各組織分布的檢測結果感染后第4 d 各組隨機剖殺3 只，采集臟器進行B 亞型aMPV 檢測，結果顯示，感染組肉雞喉頭、鼻甲骨病毒檢出率均為100%，氣管、哈式腺檢出率為33%（1/3只），肺臟檢出率為0；其中鼻甲骨的病毒拷貝數最高，達3.53×104拷貝/0.1 g，喉頭次之，為1.87×104拷貝/0.1 g，哈氏腺和氣管檢出率相對較低，而肺臟中未檢測到病毒；空白組雞均未檢測到病毒（圖2）。表明商品肉雞感染B亞型aMPV 后病毒主要存在于上呼吸道，其中鼻甲骨含量最高。

圖2 病毒組織分布檢測結果Fig.2 Detection of virus tissue distribution

2.4 肉雞血清抗體水平檢測分別于感染后7 d、14 d、21 d 對感染組和空白組肉雞采血，分離血清后采用ELISA 試劑盒檢測抗體水平，結果顯示，感染后第7 d，感染組肉雞均抗體轉陽，隨著時間推移，血清抗體水平逐漸升高。感染組肉雞感染后第7 d、第14 d 和第21 d 的aMPV 抗體效價平均值分別為1∶3 665、1∶4 684和1∶8 202；而空白組肉雞各時間點均未檢測到aMPV 特異性抗體（圖3）。表明商品肉雞感染B 亞型aMPV 后7 d 抗體轉陽，且抗體水平隨時間推移呈上升趨勢。

圖3 各組雞抗體水平檢測結果Fig.3 Detection results of serum antibody

2.5 肉雞組織病理學檢測結果感染后第9 d，采集感染組和空白組肉雞的鼻甲骨、氣管和肺臟，制備病理切片并觀察各組織病變，結果顯示，感染組肉雞鼻甲骨的鼻黏膜固有層有炎癥性細胞及嗜酸性粒細胞浸潤（圖4A）；肺臟有淤血（圖4B）；氣管黏膜固有層內也存在較多炎性細胞浸潤，黏膜上皮細胞部分變性或壞死（圖4C）?？瞻捉M肉雞各組織均未見明顯的病理變化（圖4D～圖4F）。上述結果表明，B 亞型aMPV 感染能夠引起商品肉雞的呼吸器官發生不同程度的炎癥反應，主要表現為炎性細胞浸潤。

圖4 各組雞各組織病理學檢測結果Fig.4 Histopathologic changes in tissues from aMPV LN16 infected chickens

3 討 論

1998 年，我國首次報道了黑龍江某肉種雞場感染aMPV[11]，隨后aMPV 的血清學調查結果顯示，我國遼寧、河北、山東、河南、江蘇、吉林、湖北等地區的肉種雞中均檢測到aMPV 抗體，有的雞場的血清抗體陽性率高達100%[8]。病原學調查結果顯示，在江蘇、山東、遼寧、河南、河北、黑龍江等地區的肉種雞均檢測到了B 亞型aMPV[7-8]，而A 亞型和C 亞型aMPV 僅在東南地區檢測到，這表明B 亞型aMPV 在我國肉雞群中為優勢流行亞型[7,12]。但由于該病毒分離困難，aMPV 對肉雞的致病性分析鮮有報道，本研究利用本實驗室前期分離的B 亞型aMPV LN16 株感染商品肉雞，從雞的臨床癥狀、雞體排毒情況、病毒在雞各組織中分布、血清抗體水平及部分器官組織病理學變化等方面系統的研究了B 亞型aMPV 對商品肉雞的致病性，為后期肉雞場B 亞型aMPV 感染的診斷及防控提供相應指導。

已有文獻報道火雞源B 亞型aMPV 感染16 日齡的肉雞之后主要表現為：精神沉郁、流鼻涕、咳嗽和眶下竇腫脹，并且病程較長[13]。本研究中21 日齡的商品肉雞感染雞源B 亞型aMPV LN16 株后，在感染后3 d～6 d 也出現流鼻涕、鼻痂、眼睛有泡沫等明顯的臨床癥狀，且發病率可達100%，可見雞源和火雞源的B 亞型aMPV 對商品肉雞的致病性基本一致。本研究中的感染組肉雞未出現眶下竇腫脹，其可能的原因包括：1）感染實驗均在隔離器里進行，無細菌混合感染；2）本研究的感染劑量較少，為5×103TCID50，有研究報道采用低于104TCID50感染劑量的火雞源的B 亞型aMPV 也未成功復制出眶下竇腫脹的臨床癥狀[13]。

本研究中肉雞感染B 亞型aMPV 后的1 d～6 d 均可以檢測到排毒，在第3 d 達到排毒高峰，這與前期在SPF 雞和蛋雞的研究結果一致，B 亞型aMPV 感染后的排毒期為1 d～6 d，排毒高峰期為感染后第2 d～4 d[9-10]。這些結果表明B 亞型aMPV 在不同品種雞呼吸器官中的存活時間基本一致，均僅存活較短時間，無品種的差異性，這提示在診斷該病時應在臨床癥狀初期采集鼻腔拭子進行病原檢測或分離。

病原主要接觸的鼻甲骨、喉頭、氣管、哈式腺、肺臟等部位是雞抵御呼吸道感染的重要場所[12]，本實驗中感染組商品肉雞的喉頭、鼻甲骨病毒的檢出率達100%，說明該病毒在感染商品肉雞后進入了喉頭、鼻甲骨等器官，引起了流鼻涕等癥狀。

商品肉雞在感染雞源B亞型aMPV后7 d左右抗體開始轉陽，隨著時間的推移抗體效價有所升高[14]。分子流行病學調查數據也顯示不同來源的B亞型aMPV G基因同源性較高，不低于93%[12,15]。上述實驗數據均表明不同地區和不同種群分離的B 亞型aMPV 的生物學特性基本一致，因此推測雞源B 亞型aMPV 可能來源于火雞，這提示養殖場飼養中應避免混合飼養，以防止交叉感染。

商品肉雞在感染雞源B 亞型aMPV 后9 d 各組織的病理切片結果顯示，商品肉雞感染B 亞型aMPV 后上呼吸道出現不同程度的病理損傷，說明該病毒感染肉雞后會對呼吸道器官造成損傷，引起局部炎癥反應。

本研究表明，B 亞型aMPV 對商品肉雞具有較強的致病性，主要臨床癥狀為流鼻涕、眼睛有泡沫和鼻痂等癥狀。B 亞型aMPV 可以在感染肉雞體內存活6 d左右，可造成鼻甲骨和氣管的炎性細胞浸潤，肺臟出血等病理性損傷。本研究首次揭示了商品肉雞感染B 亞型aMPV 后的發病進程及發病規律，為肉雞場B亞型aMPV 感染的診斷與防控提供了重要參考依據。