內生細菌對NaCl脅迫下小麥幼苗的緩解作用

杜欣 楊林美# 姜夢柯 曾忠秀 李夢霜 李中源 李淑英

摘 要：選擇小麥種子作為研究材料，水培條件下進行種子萌發，待小麥幼苗長至15cm時，對小麥幼苗進行NaCl脅迫培養，同時接種紫莖澤蘭（Crofton Weed）根分離到的1株內生細菌，通過測定小麥葉片Pro（脯氨酸）和MDA（丙二醛）含量、PPO（多酚氧化酶）和CAT（過氧化氫酶）活性變化，探究內生細菌對NaCl脅迫培養后小麥的緩解作用。結果表明：NaCl脅迫培養條件下接種紫莖澤蘭內生細菌后，小麥葉片CAT活性及Pro含量增加;小麥葉片PPO活性及MDA含量變化沒有明顯規律性，低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫培養時接種紫莖澤蘭內生細菌短時間內（本試驗為7d）對小麥生長有緩解作用，說明紫莖澤蘭內生細菌對NaCl（150mmol/L）脅迫培養的小麥幼苗生長有一定的修復作用，紫莖澤蘭內生細菌在高鹽（NaCl 300mmol/L）條件下生長繁殖受抑制。

關鍵詞：內生細菌;NaCl脅迫;小麥葉片;生理生化

中圖分類號 S512.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）01-0015-04

Alleviating Effect of Endophytic Bacteria on Wheat Seedlings under NaCl Stress

DU Xin# ?YANG Linmei# ?JIANG Mengke ?ZENH Zhongxiu ?LI Mengshuang ?LI Zhongyuan ?LI Shuying

（College of Chemical Biology and Environment， Yuxi Normal University， Yuxi 653100， China）

Abstract： This experiment took wheat seeds as research materials， made seed germination under hydroponic conditions， cultured the wheat seedlings under NaCl stress when they grew to 15cm height， inoculated with an endophytic bacterium isolated from the root of Crofton Weed， and explored the alleviating effect of endophytic bacteria on wheat leaves after NaCl stress culture through determining the contents of ?Pro （proline） and MDA （malondialdehyde） and the changes of activity of PPO （polyphenol oxidase） and CAT （catalase）. The results showed that the CAT activity and Pro content of wheat leaves increased after inoculation with endophytic bacteria of Crofton Weed under NaCl stress; no obvious regularity in the changes of PPO activity and MDA content was found in wheat leaves; inoculation of Eupatorium adenophorum endophytic bacteria could alleviate the growth of wheat in a short time （this experiment is 7d） under low salt （NaCl 150mmol/L）， indicating that Crofton Weed endophytic bacteria can repair the growth of wheat seedlings cultured under NaCl （150mmol/L） condition， and the growth and reproduction of Endophytic Bacteria of Eupatorium adenophorum were inhibited under the condition of high salt （NaCl 300mmol/L）.

Key words： Endophytic bacteria; NaCl stress; Wheat leaf; Physiology and biochemistry

鹽漬化嚴重影響作物生長，鹽漬化環境中生長的農作物會在生長特征和生理生化特征方面都呈現出一定的變化。田菁等[1]發現鹽脅迫處理影響小麥幼苗的形態和生理特性，對其生長有負面影響。當土壤的鹽濃度高于70mmol/L，農作物已經表現出脅迫作用，高于100mmol/L則作物生長發育受到嚴重影響，產量急劇下降[2]，同時植物中的游離脯氨酸、丙二醛、可溶性蛋白質會有明顯的增加[3，4]，鹽脅迫使得小麥生長受阻，光合系統和酶系統受到干擾，進而影響小麥產量和質量[5]。

鹽漬化土壤修復技術較多，而微生物技術[6-8]由于其成本低、污染小、可持續等優點，在開發利用方面得到重視。植物內生細菌分布于植物的不同組織中，受到植物組織的保護而不受外界惡劣環境（如強烈日光、紫外線、風雨等）的影響，而且有充足的營養物質，因此具有穩定的生態環境，占據有利于生防的生態位，相對于腐生細菌更易于發揮生防作用[9]。在惡劣環境中，植物內生細菌可促進植物生長，改善植物營養吸收，影響酶及代謝產物活性，增強植物抗逆性。植物內生細菌作為生物防治菌株，發展迅速，成為當前微生物學領域研究的熱點[10]。本試驗選擇小麥種子在水培條件下萌發及培養一段時間后，接種從紫莖澤蘭根部分離到的內生細菌，通過檢測小麥葉片Pro（脯氨酸）、MDA（丙二醛）、PPO（多酚氧化酶）、CAT（過氧化氫酶）含量或活性變化，探討接種內生細菌對不同鹽濃度脅迫下小麥幼苗生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 小麥種子：市場購買。內生細菌：紫莖澤蘭（Crofton Weed）根部分離得到。牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌30min后35℃恒溫無菌檢查24h后備用。LB培養基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌30min后35℃恒溫無菌檢查24h后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生細菌的分離純化 新鮮健康紫莖澤蘭根沖洗干凈，吸干水分剪切成2cm的小段，75%乙醇漂洗3min，無菌水沖洗4～5次，5%次氯酸鈉溶液漂洗3min，無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干水分，研磨成汁過濾，取0.5mL置于4.5mL無菌水稀釋為10-1，10倍梯度稀釋至10-2、10-3，無菌操作分別取0.5mL涂布接種于牛肉膏蛋白胨平板，每個稀釋梯度接種2個平板，35℃培養24～48h后選取長勢良好單菌落純化2～3次后保存。

1.2.2 內生細菌的活化和菌懸液制備 將所獲菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養基斜面，置于30℃恒溫培養24～48h后轉接于LB液體培養基，置于30℃（130r/min）震蕩培養5d，10000r/min離心10min，收集菌體，用無菌水稀釋成菌懸液，調整OD600值≈1，4℃保存備用。

1.2.3 小麥種子鹽脅迫培養及內生細菌接種 挑選新鮮健康的小麥種子，用無水乙醇浸泡15～20s，置于5%次氯酸鈉溶液消毒3～5min，再用無菌水沖洗5～8次。無菌水浸泡小麥種子12h，白瓷盤鋪墊紗布，水量放至合適位置，均勻放置小麥種子。待小麥發芽，幼苗長至15cm高時進行NaCl脅迫培養，設置1個對照組+4個試驗組：CK、低鹽脅迫（NaCl濃度為150mmol/L）、低鹽脅迫（NaCl濃度為150mmol/L）+接種內生細菌、高鹽脅迫（NaCl濃度為300mmol/L）、高鹽脅迫（NaCl濃度為300mmol/L）+接種內生細菌（NaCl濃度為300mmol/L）。具體過程：CK中加300mL無菌水，低鹽及高鹽試驗組各加300mL鹽溶液、低鹽及高鹽+內生細菌試驗組各加菌懸液鹽溶液300mL，隔1d加1次，共計10次;第7d時開始取樣測定小麥葉片中的脯氨酸和丙二醛含量，過氧化氫酶和多酚氧化酶活性，每隔7d測定1次，共測3次。

1.3 測定項目 采用磺基水楊酸法[11]提取及測定小麥葉片脯氨酸（Pro）含量，波長520nm，標準曲線為：y=0.0226x-0.0019，R2=0.9915。采用雙組分分光光度法測定丙二醛（MDA）含量，具體過程及計算參照[11]進行，略作調整。多酚氧化酶（PPO）活性測定參照文獻[11]的方法，測定波長為410nm，具體過程參照[11]進行。采用紫外吸收法[12]測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，波長240nm。

2 結果與分析

2.1 小麥葉片CAT活性變化 研究[13]發現，CAT與鹽脅迫耐受相關，隨著脅迫時間的延長，處理組的過氧化氫酶活性呈現先升高后降低的趨勢[14]。由圖1可知，對照組及2個試驗組21d水培過程中CAT的變化也表現為先升高后降低的趨勢，水培小麥7、14、21d在NaCl濃度為150mmol/L、300mmol/L時接種紫莖澤蘭內生細菌后CAT的活性均高于NaCl試驗組及對照組，說明在水培條件下紫莖澤蘭內生細菌可以在一定程度上緩解NaCl脅迫培養對小麥造成的影響，對小麥生長有一定的修復作用[15]，能提高小麥對NaCl脅迫抗逆性，其中7d時低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫后紫莖澤蘭內生細菌對小麥的修復效果達到79.11%，比CK高44.02%，高鹽（NaCl 300mmol/L）時也有一定修復效果，達到19.11%;14d時CK及試驗組CAT都有降低，但紫莖澤蘭內生細菌對低鹽（NaCl 150mmol/L）及高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫培養小麥后依然有修復作用，低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫條件下修復作用較明顯，高達109.49%;水培條件21d時，紫莖澤蘭內生細菌對NaCl 脅迫培養小麥后的修復效果明顯，低鹽（NaCl 150mmol/L）時修復效果達到108.17%，高于CK 118.37%，高鹽（NaCl 300mmol/L）時達到59.94%，高于CK 106.94%，說明水培時間越長，紫莖澤蘭內生細菌對NaCl脅迫修復效果越明顯，具體有效修復時間及機理有待深入研究。

2.2 小麥葉片PPO活性變化 PPO對植物抵御外界脅迫、光合作用、生物合成等起重要作用[16]，是參與酚類聚合的酶，酚類物質可促進細胞壁和組織木質化，影響細胞壁中木質素的合成，木質素是植物抵御外界脅迫的天然屏障之一[17]，酚類物質的積累被認為與植物抵御非生物脅迫有關，在冷脅迫、水分脅迫條件下均觀察到該現象[18，19]。由圖2可知，CK及試驗組的PPO均呈現出先升高后降低趨勢。彭淼[20]研究發現，外源鈣對干旱脅迫下草莓PPO活性變化也表現為先升高再降低。低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫培養小麥后接種紫莖澤蘭內生細菌試驗組，脅迫培養7d時PPO活性低于CK及低鹽（NaCl 150mmol/L）試驗組，說明紫莖澤蘭內生細菌的外源性添加在短時間內可以提高小麥對NaCl的抗性，表現出一定修復作用，修復效果為44.50%，隨著脅迫時間延長，NaCl（150mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌后PPO活性高于NaCl（150mmol/L）脅迫試驗組，紫莖澤蘭內生細菌的修復作用逐漸消失;高鹽（NaCl 300mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌試驗組7、14、21d時，小麥葉片中的PPO都高于高鹽（NaCl 300mmol/L）試驗組，說明紫莖澤蘭內生細菌在高鹽（300mmol/L）狀態下沒有對小麥生長產生修復作用。研究[21] 發現NaCl濃度過高會影響內生細菌的生長繁殖。

2.3 小麥葉片Pro含量變化 植株體內脯氨酸（Pro）含量在一定程度上反映了植株體的抗逆能力[22]。滕松山[23]在鹽生植物堿蓬中分離獲得1株內生細菌（Pseudomonas oryzihabitans LP11），在鹽分脅迫條件下可提高種子萌發率，增加植物葉綠素、可溶性糖及脯氨酸含量，促進植物生長，提高抗鹽性。由圖3可知，小麥幼苗在低鹽（NaCl 150mmol/L）和高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫培養條件下，小麥葉片中的Pro含量明顯增加，Pro變化與時間及NaCl濃度等有一定關系。謝強等[24]認為，在脅迫條件下，大多抗逆性強的品種能夠積累較多的脯氨酸。本試驗中，低鹽（NaCl 150mmol/L）及低鹽（NaCl 150mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌脅迫小麥時，小麥葉片中Pro含量隨培養時間延長逐漸增加，7d時高于CK 215.29%、465.63%，14d時高于CK 109.95%、223.34%，21d時高于CK 421.03%、426.54%，低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫且接種紫莖澤蘭內生細菌試驗組Pro含量均高于低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫試驗組，說明紫莖澤蘭內生細菌對低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫小麥有一定修復作用[25]，修復效果分別為79.40%（7d）、54.01%（14d）、1.06%（21d），修復效果在逐漸減弱;高鹽（NaCl 300mmol/L）及高鹽（NaCl 300mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌后試驗組Pro有明顯增加，Pro含量均高于低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫試驗組，但高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫接種紫莖澤蘭內生細菌后小麥葉片Pro含量低于高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫試驗組及低鹽（NaCl 150mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌試驗組，修復效果逐漸減弱，這可能是NaCl會影響內生細菌的生長繁殖[21]進而影響到對小麥生長損傷的修復效果 。

2.4 小麥葉片MDA含量變化 研究[26]發現采用NaCl處理后蓮藕幼苗后葉片中的丙二醛含量升高，鹽脅迫對植物造成質膜氧化，產生大量的丙二醛（MDA），并調節抗氧化酶活性來抵御逆境環境[27]，MDA含量變化與NaCl濃度有正相關關系[28]。由圖4可知，4個試驗組MDA的含量幾乎都高于CK，NaCl脅迫培養導致小麥葉片MDA含量增加，其中低鹽（NaCl 150mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌試驗組脅迫培養小麥7d后，比低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫試驗組中MDA含量低，而脅迫培養14d和21d后都高于低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫試驗組中MDA，說明紫莖澤蘭內生細菌在短時間內對小麥生長有一定修復作用，修復效果為8.37%;高鹽（NaCl 300mmol/L）接種紫莖澤蘭內生細菌后小麥葉片MDA含量變化不明顯（分別為34.32、35.93、35.77μmol/g），而高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫培養小麥后，小麥葉片的MDA呈上升趨勢，說明高濃度NaCl（300mmol/L）對小麥葉片細胞膜有損傷，紫莖澤蘭內生細菌可以在一定程度上減輕這種損傷作用。

3 結論與討論

本研究結果表明，NaCl脅迫培養小苗使小麥葉片CAT活性先升后降，NaCl脅迫培養條件下接種內生細菌可以使CAT的活性增加，說明紫莖澤蘭內生細菌對NaCl脅迫培養的小麥生長有一定的修復作用。小麥葉片 Pro的含量受脅迫培養時間及NaCl濃度的影響，NaCl脅迫導致小麥葉片Pro含量增加，低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫培養時外源加入紫莖澤蘭內生細菌對小麥的生長有修復作用，而脅迫培養時間延長及高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫培養條件下，紫莖澤蘭內生細菌對小麥的生長也沒有明顯的修復作用。小麥葉片PPO活性及MDA含量的變化表明，小麥在低鹽（NaCl 150mmol/L）脅迫培養時加入紫莖澤蘭內生細菌短時內（本試驗為7d）對小麥的生長有修復作用，而脅迫培養時間延長及高鹽（NaCl 300mmol/L）脅迫培養條件下，紫莖澤蘭內生細菌對小麥的生長沒有明顯修復作用。

參考文獻

[1]田菁，宋爽.鹽脅迫對小麥幼苗形態及生理特性的影響[J].安徽農業科學，2010，38（15）：7784-7787.

[2]卞阿娜，林鳴，王文卿，等.根系鹽脅迫鹽生植物和甜土植物的幼苗生長及礦質元分布的影響[J].熱帶亞熱帶植物學報，2015，23（4）：405-412.

[3]郭紅玲.鹽脅迫下小麥幼苗生長的影響及機理研究[J].農業開發與裝備，2018（8）：120，124.

[4]胡愛雙，張小棟，王文成，等.鹽脅迫對不同耐鹽性八棱海棠株系生理特性的影響[J].果樹學報，2021，38（3）：335-343.

[5]陳劉平，陳巧艷，李新華，等.NaCl脅迫對小麥苗期和灌漿期生理生化特性及產量性狀的影響[J].江蘇農業科學，2019，47（13）：85-90.

[6]楊璐，周蓓蓓，侯亞玲，等.枯草芽孢桿菌菌劑對鹽脅迫下冬小麥生長與土壤水氮分布的影響[J].排灌機械工程學報，2021，39（5）：517-523.

[7]王魯，魏宏達，方可，等.解淀粉芽孢桿菌HM618對鹽脅迫下小麥幼苗生長及生理特性的影響[J].天津農業科學，2020，26（12）：33-37.

[8]邊建文，崔巖，楊宋琪，等.衣藻和固氮魚腥藻對鹽脅迫下小麥幼苗生長的影響[J].浙江農業學報，2020，32 （10）：1748 -1756.

[9]冉國華，張志元.植物內生細菌研究及其應用[J].海南大學學報（自然科學版），2004，22（4）：366-370.

[10]強夢軻，徐奕卓，高蕊. 植物內生細菌介導的植物抗逆性研究進展[J].植物學研究，2020，9（3）：226-239.

[11]劉新，劉洪慶.植物生理學試驗[M].北京：高等教育出版社，2018：3.

[12]湯紹虎，羅充.植物生理學試驗教程[M].重慶：西南師范大學出版社，2012：6.

[13]GONDIM F A，GOMES- FILHO E，COSTA J H，et al. Catalase plays a key role in salt stress acclimation induced by hydrogen peroxide pretreatment in maize[J]. Plant Physiology & Biochemistry，2012，56：62-71.

[14]李博書，秦昕宇，董文濤，等.干旱脅迫對大豆幼苗過氧化物酶和過氧化氫酶活性的影響[J].糧油農資，2020（10）：8-9.

[15]趙龍飛，徐亞軍，賴心河，等.內生細菌252和254對鹽脅迫下小麥幼苗過氧化物酶和過氧化氫酶活性的影響[J].應用生態學報，2017，28（9）：2984-2992.

[16]王馨雨，楊綠竹，王婷，等.植物多酚氧化酶的生理功能、分離純化及酶促褐變控制的研究進展[J].食品科學，2020，41（09）：222-236.

[17]REN G H，WANG B J，ZHU X D，et al. Cloning，expression，and characterization of miR058 and its target PPO during the development of grapevine berry stone[J].Gene，2014，548（2）：166-173.

[18]AHMADIPOUR S，ARJI I，EBADI A，et al. Physiological and biochemical responses of some olive cultivars （Olea europaea L.） to water stress[J]. Cellular and Molecular Biology，2018，64（15）：20-29.

[19]ORTEGA-GARCíA F，PERAGóN J. The response of phenylalanine ammonia-lyase，polyphenol oxidase and phenols to cold stress in the olive tree （Olea europaea L. cv. Picual）[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89（9）：1565-1573.

[20]彭淼，鐘曉紅，張玲，等.鈣對干旱脅迫下草莓SOD、CAT、PPO活性的影響[J].長江大學學報（自然科學版），2009，6（1）：11-14.

[21]傅蕾，李霞，高璐，等.鹽脅迫下泛菌屬內生細菌對雜交狼尾草發芽及生理的影響[J].草業科學，2017，34（10）：2099-2108.

[22]朱虹，祖元剛，王文杰，等.逆境脅迫條件下脯氨酸對植物生長的影響[J].東北林業大學學報，2009，37（4）：86-89.

[23]滕松山.具ACC脫氨酶活性的堿蓬內生細菌對植物的解鹽促生作用及其ACC脫氨酶基因的克隆[D].濟南：山東師范大學，2011.

[24]謝強，陳莉.在抗性條件下脯氨酸積累對苔蘚植物的作用[J].現代園藝，2020（15）：51-51，130.

[25]徐亞軍，趙龍飛，邢鴻福，等.內生細菌對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸和丙二醛的影響[J].生態學報，2020，40（11）：3726-3737.

[26]李淑艷，印荔，蔣潤枝，等.外源Ca2+對蓮藕幼苗鹽脅迫的緩解效應[J].試驗研究，2017（6）：11-19.

[27]賀韻雅，于海峰，楊蕾.鹽脅迫下發狀念珠藻膜脂的過氧化及抗氧化響應[J].青島科技大學學報（自然科學版），2011，32（6）：626-629.

[28]劉慧，劉治婷，於麗華，等.不同NaCl濃度下甜菜葉片MDA含量及抗氧化酶活性的動態變化[J].中國甜菜糖業，2017（1）：1-4.

（責編：徐世紅）