家族性腺瘤性息肉病與散發性結直腸腺瘤血清代謝物特征譜的比較分析

尹馥梅， 郭家池， 許俊鋒， 張 杰， 王鳳玉， 潘元明， 盛劍秋，

1.解放軍醫學院，北京 100853； 2.中國人民解放軍總醫院第七醫學中心消化內科； 3.中國人民解放軍總醫院第一醫學中心消化內科醫學部； 4.首都醫科大學附屬北京胸科醫院腫瘤研究中心

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)和散發性結直腸腺瘤(colorectal adenoma，CRA)是結直腸癌主要的癌前病變，其中85%～90%的結直腸癌來源于CRA[1]，1%來源于FAP[2]。FAP作為一種常染色體顯性遺傳病，若不及時處理，結直腸癌的風險可達100%，遠高于CRA。FAP發生腺瘤通常由家族性腺瘤樣結腸息肉病易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)等位基因發生突變引起[3]，其中一個等位基因發生遺傳突變，而另一等位基因發生體細胞突變或基因缺失，進而導致功能性APC蛋白缺失和β-連環蛋白異常蓄積[4]。近年來，隨著代謝組學相關技術的快速發展，越來越多的研究開始關注疾病相關代謝物的變化，其中血液代謝物的異常分布與結直腸癌的發展已成為研究熱點[5-6]。有研究[7]表明，APC基因突變致使Wnt信號通路及其靶基因發生轉錄激活后會引起代謝譜的改變。因此，本研究基于超高效液相色譜串聯質譜(ultra-high performance liquid chromatography and tandem mass-spectrometry，UPLC-MS/MS)檢測平臺，通過Metwell數據庫和多元統計分析，比較FAP與CRA患者的血清代謝物差異，篩選出FAP特異性代謝譜，為其發病機制的深入研究提供新的思路，同時根據重要代謝譜特征，為FAP疾病的發展建立預警指標模型提供相關基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象在2017年3月1日至2020年12月31日于中國人民解放軍總醫院第七醫學中心消化內鏡中心行結腸鏡檢查的患者中進行篩選。最終共收集32例受試者，包括FAP患者(n=24)和性別、年齡相匹配的CRA患者(n=8)。本研究經中國人民解放軍總醫院第七醫學中心倫理委員會批準(No.2022-132)，所有受試者均同意留取血液標本，并簽署知情同意書。

1.2 血液標本收集及保存晨起空腹采集外周血5 ml(采用不含抗凝劑的真空采血管)，靜置60 min待血液凝固。隨后，以3 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min。最后將上清液分裝至凍存管，保存在-80 ℃冰箱中。

1.3 血清樣品制備從-80 ℃冰箱中取出血清樣品，在4 ℃下解凍。取100 μl血清于EP管中，加入甲醇300 μl。隨后，使用攪拌機(MM400，Retsch)，渦旋3 min后，在12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min。最后，取上清液于新的EP管中，在12 000 r/min，4 ℃條件下再次離心3 min后，吸取上清液保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜與質譜分析數據采集儀器系統主要包括UPLC-MS/MS。液相條件主要包括：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相：A相為超純水(0.04%的乙酸)，B相為乙腈(0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min水/乙腈(95∶5 V/V)，11.0 min為5∶95 V/V，12.0 min為5∶95 V/V，12.1 min為95∶5 V/V，15.0 min為95∶5 V/V；流速0.4 ml/min；柱溫為40 ℃；進樣量為5 μl。質譜條件主要包括：電噴霧離子源溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V，簾氣25 psi，碰撞誘導電離參數設置為高。在三重四級桿中，每個離子對是根據優化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

1.5 數據處理和代謝組學分析

1.5.1 數據預處理：基于Metwell數據庫及代謝物信息公共數據庫，使用軟件Analyst1.6.1對質譜檢測的一級譜、二級譜數據進行定性分析。通過MultiaQuant軟件，利用三重四級桿質譜的多反應監測模式(multiple reaction monitoring，MRM)進行定量分析，對色譜峰進行積分和校正，每個色譜峰的曲線下面積代表對應物質的相對含量。

1.5.2 質控分析：本實驗主要采用的是主成分分析(principal component analysis，PCA)，我們在PCA過程中每10個檢測分析樣本中插入1個質控樣本(quality control，QC)，以監測血清樣本分析過程的重復性和穩定性。其中，QC由樣本提取物混合制備而成。QC樣本聚集得越好，就越表明儀器的穩定，則采集到的數據質量越好。

2 結果

2.1 FAP和CRA患者的臨床資料本研究共納入32例受試者，24例FAP患者分別來自22個確診的FAP家系，男12例，女12例，年齡(38.0±14.9)歲(16～69歲)；8例CRA患者選自我院消化內科門診，男4例，女4例，年齡(42.4±5.2)歲(34～52歲)。兩組患者在性別(P=0.5)和年齡(P=0.43)方面比較，差異無統計學意義，FAP和CRA患者的結腸鏡下表現和病理特征如圖1所示。

2.2 FAP與CRA的血清代謝譜比較PCA評分圖顯示了CRA與FAP組之間的分離趨勢，兩組之間存在明顯差異(見圖2A)。隨后構建OPLS-DA模型，并基于238種代謝物，選出前10個上調(紅色標記)和前10個下調的(綠色標記)代謝物(見圖2B)。通過兩個正交成分和一個預測成分(R2X=0.619，R2Y=0.999，Q2Y=0.995)(見圖2C)來證明建模和預測能力。進一步對OPLS-DA模型進行排列驗證(n=200，即進行200次排列實驗)(見圖2D)。最終結果表明，通過UPLC-MS/MS檢測的FAP患者的血清代謝譜與CRA組不同。

2.3 FAP血清特異性代謝物篩選基于OPLS-DA模型的結果，我們同時選擇符合VIP值(≥1)和FC(≤0.5或≥2)條件的代謝物，最終確認了85個顯著差異代謝物，其中20個上調代謝物，65個下調代謝物。圖3A的火山圖展示了FAP組和CRA組血清代謝物表達的差異。為了進一步挖掘代謝物的變化，我們對具有顯著差異的代謝物進行了歸一化處理，并繪制了聚類熱圖(見圖3B)。與CRA組相比，反，反-粘康酸(Trans, Trans-muconic acid)是FAP患者代謝物中表達下降最為顯著的一種，其倍數變化最大(FC=483.4)。1，5-無水葡萄糖醇(1,5-anhydro-D-glucitol)是FAP患者中表達增加最為顯著的代謝物(FC=4.33×10-5)。如圖2B所示，顯著上調前10位的血清代謝物包括1，5-無水葡萄糖醇、阿糖肌苷(Hypoxanthine-9-B-D-arabinofuranoside)、苯丙氨酸二肽(Phe-Phe)、D-木糖酸鋰鹽(D-xylonic acid lithium salt)、3-甲基-2-氧基丁酸(3-methyl-2-oxobutanoic acid)、D-天冬氨酸(D-aspartic acid)、乳清酸(Orotic acid)、氫化肉桂酸(Hydrocinnamic acid)、L-鳥氨酸(L-ornithine)和2，6-二氨基庚二酸(2,6-Diaminooimelic acid)。顯著下調的前10位血清代謝物包括反，反-粘康酸(Trans, Trans-muconic acid)、L-瓜氨酸(L-citrulline)、N-乙酰-L-亮氨酸(N-acetyl-L-leucine)、?；蛆Z脫氧膽酸(Taurochenodesoxycholic acid)、甘氨脫氧膽酸(Glycodeoxycholic acid)、L-無水天冬酰胺(L-asparagine anhydrous)、甲基丙二酸(Methylmalonic acid)、?；悄懰?Taurocholic acid)、甘氨鵝脫氧膽酸(Glycochenodeoxycholic acid)和棕櫚烯酸[Palmitoleic acid (C16∶1)]。

注：A：PCA圖；B：前10個上調(紅色標記)和前10個下調(綠色標記)的代謝物；C：OPLS-DA圖(R2X、R2Y和Q2Y是評估模型的預測參數，這三個指標越接近1，模型越穩定且可靠，Q2Y>0.5視為有效模型，Q2Y>0.9視為出色的模型)；D：OPLS-DA模型驗證。

2.4 FAP特異性代謝物功能分析KEGG數據庫分析結果表明，如圖3C～3D所示，與CRA組相比，FAP組有77個關鍵代謝途徑改變，其中主要涉及氨基酸和核苷酸代謝(包括谷胱甘肽代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)、碳水化合物代謝和脂肪酸代謝等。本研究將主要關注表1中碳水化合物和氨基酸的改變。與CRA組相比，FAP患者的1，5-無水葡萄糖醇表達明顯升高，木糖醇、L-巖藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、A-D-葡萄糖、阿拉伯糖和吡喃葡萄糖表達下降。在氨基酸中，甘氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和瓜氨酸表達顯著降低。

表1 通過KEGG分析鑒定的碳水化合物和氨基酸代謝中的主要代謝產物

注：A：火山圖(每個點代表代謝物)；B：聚類熱圖；C：KEGG注釋代謝物分類；D：KEGG富集的代謝產物分類。

3 討論

近年來，分析和監測與疾病相關的代謝改變，尤其是腫瘤微環境與代謝途徑的變化，以探索更多的潛在機制逐漸成為研究熱點。有研究[8]通過SW480細胞和APCmin/+小鼠表達APC基因截短蛋白表明，APC基因突變會導致機體代謝譜的改變。然而，截至目前在FAP患者中分析APC突變引起的代謝組學變化的研究甚少。本研究通過UPLC-MS/MS分析，首次比較分析了FAP和CRA的血清代謝譜特征，掌握了APC基因突變引起的代謝特征。共篩選出85種在兩組中具有明顯差異的代謝物，包括表達上調的20種和表達下調的65種。進一步通過KEGG分析發現，與CRA組相比，FAP患者的碳水化合物代謝中，木糖醇、L-巖藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、A-D-葡萄糖、阿拉伯糖和吡喃葡萄糖的表達均下降，而1，5-無水葡萄糖醇的表達明顯升高。同時FAP患者氨基酸代謝異常，包括甘氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和瓜氨酸表達顯著降低。本研究結果表明，FAP患者血清中存在特征性代謝譜改變，涉及碳水化合物代謝和氨基酸代謝。有研究[8-9]發現，APC基因突變導致功能喪失引起Wnt/β-catenin信號過度激活，可能調控三羧酸(Tricarboxylic acid，TCA)循環和氨基酸代謝相關的通路。

與CRA相比，在FAP患者的碳水化合物代謝中，木糖醇、L-巖藻糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、A-D-葡萄糖、阿拉伯糖和吡喃葡萄糖的表達均下降，而1，5-無水葡萄糖醇的表達明顯升高。這些代謝物均與糖酵解、TCA循環等碳水化合物相關，可能是因為FAP患者的高腺瘤負荷導致的能量供給不足[10]。FAP患者的1，5-無水葡萄糖醇是急性葡萄糖波動(葡萄糖峰值)的標志物，其表達升高表明體內存在低血糖，可能成為監測FAP患者癌變的潛在生物標志物[11]。

與CRA相比，我們發現FAP患者的甘氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和瓜氨酸表達均顯著降低。其中異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸為必需氨基酸。細胞需要攝入必需氨基酸維持基本生命活動。與正常細胞相比，腫瘤細胞對必需氨基酸的需求明顯增加[12]。這與我們的研究一致，FAP患者的平均腺瘤數量遠遠大于CRA患者，同時與CRA患者相比，FAP患者對異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸等必需氨基酸的高消耗可能用于維持腫瘤細胞的快速增殖。谷氨酰胺不是必需氨基酸，它在人體內可由谷氨酸、異亮氨酸和纈氨酸合成。腫瘤細胞使用谷氨酰胺分解過程中產生的介質來參與三羧酸循環促進細胞能量代謝[13-14]。同時，谷氨酰胺和甘氨酸、半胱氨酸參與合成谷胱甘肽，其具有抗氧化功能。胱氨酸是由兩個半胱氨酸通過二硫鍵形成的。在腸道腫瘤細胞的微環境中，腫瘤細胞通過糖酵解消耗大量的氧，進而產生過多的活性氧(reactive oxygen，ROS)。ROS的積累對生物分子造成嚴重損害，導致細胞死亡[15]。因此，腫瘤細胞中需要大量的抗氧化劑(例如谷胱甘肽)來平衡ROS的產生[16]。本研究中，我們發現相較于CRA患者，FAP患者的谷氨酸和甘氨酸的表達下調，這可能與FAP患者息肉負荷量大，進而需要足量的谷氨酰胺和谷胱甘肽相關。胱氨酸的表達顯著降低可能是谷胱甘肽需求增加導致半胱氨酸的過量消耗。谷氨酸通過轉氨基作用生成天冬氨酸，天冬氨酸和瓜氨酸在精氨琥珀酸合成酶的作用下生成精氨琥珀酸，并進一步生成精氨酸，完成尿素循環。有研究[10]表明在FAP患者中，瓜氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的表達濃度顯著降低，可能是由于APC基因突變引起了氨基酸譜的變化。

本研究通過UPLC-MS/MS法檢測CRA與FAP患者的血清代謝物，篩選出FAP特征性代謝譜，并通過KEGG功能注釋和富集分析闡明其重要相關的代謝通路途徑，可為APC基因突變誘導的代謝組學改變進而導致結直腸癌發生發展的深入機制研究提供新的思路。此外，定期監測FAP患者的血清代謝物改變，可為疾病的發展提供預警。同時，根據FAP患者的特征性小分子代謝物改變，為FAP從腺瘤發展為結直腸癌的化學預防提供新的依據。本研究受限于單中心、小樣本，研究結論有待多中心以及擴大樣本量以驗證。