安徽省三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜構建

華冰清，管鵬鵬，桂利權，沈周高，張愛嘉，陶玲玲，朱俊彥，韋朝領，劉升銳*

安徽省三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜構建

華冰清1，管鵬鵬1，桂利權2，沈周高1，張愛嘉1，陶玲玲1，朱俊彥1，韋朝領1，劉升銳1*

(1.安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室、農業農村部茶樹生物學與茶葉加工重點實驗室，安徽合肥 230036；2.謝裕大茶葉股份有限公司，安徽合肥 230036)

本研究篩選了6個多態性高且穩定性好的SSR標記作為一個核心標記組，對‘黃山白茶’三個特異茶樹品種（系）及其余43份茶樹品種（系）進行基因分型，根據擴增條帶的大小構建了三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜。結果表明，6個標記擴增條帶清晰，不同樣品間具有較好的多態性，共擴增出等位基因數26個，平均為4.33；主效等位基因頻率為0.283～0.370，均值為0.335；觀測雜合度和期望雜合度均值分別為0.571和0.613；多態性信息含量為0.700～0.786，平均為0.740。根據等位基因片段大小分別構建了‘黃山白茶1號’品種、‘黃山白茶2號’品系和‘黃山白茶3號’品系的分子指紋圖譜，為‘黃山白茶’種質資源鑒定、品種保護和推廣利用提供重要理論依據。

黃山白茶；SSR標記；遺傳多態性；分子指紋

我國茶樹種質資源豐富多樣，其中新梢葉色白化茶樹品種是重要的特異資源，因其對氣候因子敏感程度不同，可分為溫度敏感型和光照敏感型[1]?！S山白茶’（‘Huangshan Baicha’）原產于安徽省歙縣境內的新安江支流，因產地居古徽州府所轄，故又名‘徽州白茶’[2]，屬于溫度敏感型白化茶樹變種[3]，其春茶芽葉呈玉白色，隨著春季氣溫升高和芽葉變大，由葉片主脈、支脈、葉肉細胞依次返綠，葉色逐漸變成黃白色、黃綠色、淺綠色，夏秋茶則為綠色[3,4]。其制成的干茶色澤略顯金黃、沖泡湯色明亮、香高持久、滋味鮮爽，游離氨基酸含量較高，且富含人體所需的硒、鐵、鋅等多種微量元素，兼具飲用與觀賞價值，備受廣大消費者青睞[4-6]。目前，通過短穗扦插繁育的無性系‘黃山白茶1號’品種（安徽省省級良種）、‘黃山白茶2號’品系和‘黃山白茶3號’品系已推廣種植?，F今，全國各地已選育出大量不同類型的白化茶樹品種，僅通過傳統的形態學鑒定難以區分，且對于溫度敏感型白化茶樹品種夏秋季返綠后與其它品種更加難以區分，為茶樹資源保護和品種鑒別帶來了一定的困難和挑戰[7]。

分子標記技術是從DNA水平上對物種的遺傳特性進行鑒定，鑒定結果準確、穩定、不受環境影響。SSR（Simple Sequence Repeat）分子標記具有共顯性、穩定性好、多態性高、且基因組分布廣泛等優點，是茶樹遺傳研究中最常用的分子標記技術之一[8,9]。目前，SSR分子標記已廣泛應用于構建茶樹品種分子指紋。如章志芳和馬建強利用10個EST-SSR標記對14個茶樹新品種進行了遺傳多樣性分析，并構建了各自特異的DNA分子指紋圖譜[10]；Tan等從30個標記中篩選了8個標記作為核心標記組，并構建了128份茶樹品種的分子指紋圖譜[11]；Liu等從36個SSR標記中篩選了5個多態性高且穩定性好的SSR標記作為核心標記組，并構建了80個茶樹品種（品系）的分子指紋圖譜[12]；阮旭等利用篩選的50對SSR標記對安徽省各個茶區共68份茶樹品系進行遺傳多樣性分析，并選出8對核心標記組構建了其各自特異的分子指紋圖譜[13]；Guo等選用了6個SSR標記作為核心標記組，構建了126份廣西茶樹種質資源的分子指紋圖譜[14]。

本研究以課題組先前開發的SSR標記為基礎，進一步篩選了6個多態性高且穩定性好的SSR標記，將其作為核心標記組，對46份茶樹品種（系）進行了快速的基因分型，構建了‘黃山白茶1號’‘黃山白茶2號’和‘黃山白茶3號’品種（系）特有的分子指紋圖譜。研究結果為‘黃山白茶’特異茶樹種質資源的鑒定、保護和利用提供了重要依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三個‘黃山白茶’品種（系）及其余43份茶樹品種（系）均來源于安徽農業大學皖中試驗站的茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室的茶樹種質資源圃（31°25′N，117°09′E），取嫩葉后用干冰速凍，置于-80 ℃冰箱保存備用。樣品名稱及產地來源詳見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測

選用EZgene TMCPPlant Miniprep Kit (Biomiga, USA)試劑盒提取茶樹樣品基因組DNA。利用NanoDrop 2000紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，所有樣品稀釋至30～50 ng·μL-1用于PCR擴增實驗。

首先對所有患牙進行完善的根管治療后，再行牙周基礎治療，包括齦上潔治、齦下刮治及根面平整術等，必要時進行調。

1.2.3 PCR擴增及毛細管電泳檢測

根據先前的研究，選取了6個多態性高、穩定性好的SSR標記作為核心標記組，并對46份供試茶樹品種（系）進行擴增以構建‘黃山白茶’特異的分子指紋圖譜。利用毛細管電泳檢測PCR產物結果可知，6個標記對46份茶樹品種（系）擴增條帶清晰、片段大小在設計片段區間內、且均顯示出較好的多態性（可參見圖1）。

根據條帶峰圖進行人工方法讀帶，建立原始數據矩陣，并根據軟件要求轉換數據格式。利用POPGENE V1.32軟件計算等位基因數（, number of alleles）和主效等位基因頻率（, major allele frequency）。利用PowerMarker 3.25軟件計算引物的觀測雜合度（, Observed heterozygosity）、期望雜合度（, Expected heterozygosity）和多態性信息含量（PIC, polymorphism information content）。

表1 選取的46份茶樹品種（系）信息

表2 六個標記的引物信息

表3 六個標記對46份茶樹品種擴增多態性分析

圖1 六個標記對46份茶樣擴增的毛細管電泳圖

圖2 三個‘黃山白茶’品種（系）的分子指紋圖譜

田間初見玉米銹病病葉時，用20%三唑酮乳油900mL/hm2，或12.5%烯唑醇 (禾果利)450～600g/hm2對水噴霧防治，視病情酌情補治。玉米螟蟲穗率達10%或花絲有蟲50頭/百穗時，先剪去穗頂花絲，再用4.5%高效氯氰菊酯乳油750～900mL/hm2對水噴玉米穗頂。

PCR反應體系、PCR擴增程序、毛細管電泳檢測及條帶分析參考相關文獻[8,12]。

1.2.4數據整理與分析

“一帶一路”項目建設中，金融發揮著十分重要的作用，金融不僅能夠實現資源配置的優化，還可發揮杠桿作用，合理調節市場經濟，在短期內快速聚集資金，為相關行業的發展奠定基礎。但是，我國金融支持與合作還面臨著很多的風險，這些均會影響金融支持與合作，使得金融行業內的不穩定因素增加，為“一帶一路”項目建設金融支持與合作帶來較大的風險與挑戰。

從本課題組先前開發的SSR標記中選取6對SSR引物[8]，序列由上海通用生物有限公司合成，引物序列及退火溫度詳見表2。

2 結果與分析

2.1 毛細管電泳檢測擴增產物

1.2.2引物選擇與合成

2.2 標記多態性分析

對檢測的6個標記進行多態性分析（可參見表3）。結果顯示，共檢測到26個等位位點數，平均為4.33個；主效等位基因頻率值在0.283（CsL68）至0.370（CsL76）之間，平均為0.335；觀測雜合度從最低的0.143（CsL60）至最高的1.000（CsL67），平均為0.571；期望雜合度在0.143（CsL60）至0.813（CsL67和CsL68）之間，平均值為0.613；多態性信息含量（PIC）在0.700（CsL76）至0.786（CsL73）之間，平均為0.740。PIC值是衡量位點多態性的最重要的指標，當PIC>0.5時為高度多態位點，當0.25

2.3 ‘黃山白茶’品種（系）分子指紋圖譜構建

毛細管電泳檢測可以清晰的顯示每個樣品擴增條帶的大小。為了更加直觀地呈現結果，6個標記CsL56、CsL60 CsL67、CsL68、CsL73和CsL76分別用A、B、C、D、E和F替代。通過標記結合擴增條帶大小的方式，編碼每個品種（系）的指紋圖譜。此外，分子指紋代碼結合品種（系）名稱、種質類型、亞種分類、選育地區等信息，構建每個品種（系）的特異分子指紋圖譜，詳見圖2。

建立參數化模型，關鍵是能明確表達模型結構的參數變量以及它們之間的關系。壓鉚連接結構參數變量如表1所示，壓鉚連接模型的結構示意圖如圖1所示。

從區域分布上看，內蒙古地區“草原絲綢之路”可分為西部段和東部段兩部分。西部段以呼和浩特、烏蘭察布、包頭、鄂爾多斯為重要支點，向西經寧夏、青海與新疆絲綢之路相連；東部段由呼倫貝爾、通遼、赤峰等重要節點城市為依托，連接著俄羅斯、蒙古國，是通往歐洲絲綢之路的重要通道。

3 討論與結論

分子標記廣泛應用于茶樹進化起源研究、遺傳多樣性分析、種質資源鑒定、基因定位、分子指紋圖譜構建等方面，具有重要作用[7,8]?；贒NA分子標記構建指紋圖譜，可以快速、準確的對植物新品種（系）及雜交后代等進行真偽鑒定，并且具有很強的個體特異性[10,11]。分子指紋可以進行品種真實性的鑒別從而保護品種權所有者的合法權益，也可以鑒定已知種質與新種質資源的區別，便于育種工作者進行遺傳研究[13,15]。

本研究篩選了6個多態性高且穩定性好的SSR標記作為一個核心標記組，利用高通量、高分辨率的毛細管電泳技術進行鑒定，分析了6個標記的遺傳多態性。結果表明，標記平均等位基因數、平均主效等位基因數和平均多態性信息含量分別為4.33、0.335和0.740，總體上各指標均較高。標記多態性的核心指標PIC值顯著高于先前的研究結果[9,16]，但與另外幾個研究結果值差別不大[11,13,14]，主要是由于這些指標受多種因素的影響，如SSR標記數目、SSR標記的重復基序次數和類型、樣本數量和遺傳背景差異大小、電泳檢測方法等[8,12]。此外，利用篩選的核心標記組成功構建了三個‘黃山白茶’特異品種（系）的分子指紋圖譜，為‘黃山白茶’特異種質資源鑒定、品種保護和推廣利用奠定了堅實基礎。

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S571.1

A

1006-5768（2022）04-174-05

2022-08-05

安徽農業大學校級大學生創新訓練項目（XJDC2020015）和安徽省科技重大專項（202003a06020021）

華冰清（1992—），女，浙江省金華市人，茶學本科生，研究方向為茶樹育種學，E-mail：1106805461@qq.com。

劉升銳（1985—），男，安徽省滁州市人，副教授，研究方向為茶樹遺傳與育種研究，E-mail：liushengrui@ahau.edu.cn。

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（責任編輯：徐千懿）