大柴胡湯治療結石性膽囊炎的網絡藥理學研究及分子對接驗證

張濤 周春宇 楊成城 張少輝 門斯燁 錢嘉惠 馬亦湘 安佳琳

摘要 目的：基于網絡藥理學和分子對接的方法探討大柴胡湯治療膽囊炎（Cholecystitis）的作用機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索相關文獻獲得大柴胡湯所含中藥的主要化學成分，收集其相對應的靶點;膽囊炎疾病靶點來源于GeneCards、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）、PharmGkb數據庫。結合Cytoscape 3.8.0構建藥物-核心靶點-有效成分網絡、靶標蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。利用Bioconductor中的R包對核心靶標進行基因本體（GO）富集和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。結果：獲得大柴胡湯活性成分151個，藥物靶點260個;疾病靶點485個;交集基因55個;PPI網絡分析發現，核心蛋白涉及TNF-α、CCK、EGFR、AKT1、VEGFA;GO富集分析得到2 307個GO條目。大柴胡湯包含細胞組分92個，生物過程2 126個，分子功能89個，主要有受體配體活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合、磷酸酶結合等;KEGG通路富集分析發現大柴胡湯主要涉及AGE-RAGE信號通路、白細胞介素-17信號通路以及HIF-1信號通路等。結論：通過網絡藥理學分析發現，大柴胡湯多成分、多靶點調控機體，通過多途徑起到治療結石性膽囊炎的作用。

關鍵詞 大柴胡湯;膽囊炎;網絡藥理學;靶點;蛋白;信號通路;分子對接

Abstract Objective：To explore the mechanism of Dachaihu Decoction in the treatment of cholecystitis based on network pharmacology and molecular docking.Methods：the main chemical constituents of Dachaihu Decoction were obtained from TCMSP and related literature，and the corresponding targets were collected; the targets of cholecystitis were from GeneCards，OMIM and PharmGKB databases.Combined with Cytoscape 3.8.0，the drug core target active component network was constructed，and the target protein interacted with PPI network.The r-packet of Bioconductor was used to enrich go and analyze KEGG pathway.Results：A total of 151 active components and 260 drug targets of Dachaihu Decoction were obtained; 485 disease targets were obtained; 55 intersection genes were obtained; PPI protein network analysis showed that core proteins involved TNF-α，CCK，EGFR，AKT1，VEGFA; and 2 307 go entries were enriched in go.There were 92 cell components，2 126 biological processes and 89 molecular functions，mainly including receptor ligand activity，cytokine activity，cytokine receptor binding，phosphatase binding，etc.; KEGG pathway enrichment analysis found that it mainly involved age-rage signaling pathway，interleukin-17 signaling pathway and HIF-1 signaling pathway.Conclusion：through the analysis of network pharmacology，Dachaihu Decoction has the effect of treating calculous cholecystitis by multi-component and multi-target regulation.

Keywords Dachaihu Decoction; Cholecystitis; Network pharmacology; Target; Protein; Signal pathway; Molecular docking

中圖分類號：R285文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.011

隨著人們生活水平的不斷提高，結石性膽囊炎的發病也逐漸呈上升趨勢。據報道膽囊結石的患病率為10%～15%，且有逐年升高的趨勢。手術切除膽囊一直是治療本病的根本措施。手術雖有根治作用，但是由于術后體內產生膽石的微環境并未改變，術后膽石復發率仍居高不下，難免存在諸多后遺癥，如膽管殘留結石、膽漏、膽管擴張、肝外膽管損傷等，不易被患者接受。

中醫認為結石性膽囊炎當屬于中醫學“脅痛”“膽脹”“黃疸”等范疇，認為其與肝膽氣郁有密切關系。以大柴胡湯為代表的處方治療結石性膽囊炎取得了良好的臨床療效。在實驗研究中，大柴胡湯的藥理學研究也相對成熟。但是當前針對大柴胡湯治療結石性膽囊炎的作用機制研究尚未清楚。故我們基于網絡藥理學的研究方法探討大柴胡湯治療結石性膽囊炎的治療機制。

1 材料與方法

1.1 大柴胡湯藥物化學成分收集及藥物靶點預測

登錄中藥系統網絡藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）[1]（網址http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）。數據庫（Database）選擇TCMSPTM，設置搜索條目為Herb name。為篩選大柴胡湯的有效化學成分（Ingredients），在搜索條目下分別輸入大柴胡湯的藥物組成：柴胡、黃芩、大黃、枳實、半夏、白芍、生姜、大棗。設置篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18[2]。完整復制各中藥符合篩選條件的所有Ingredients于文本文檔中。為篩選大柴胡湯各中藥目標靶點（Targets Information），在輸入界面選擇Related Targets，完整復制各中藥符合篩選條件的所有Targets information于文本文檔中。因甘草為佐使藥，所含有效化學成分多且復雜，為保證真實有效性，按OB≥60%篩選有效化學成分及靶點。數據庫所獲得的藥物有效化學成分及靶點信息應用Drugbank[3]（https：//www.drugbank.ca/）使其格式標準化。

1.2 疾病靶點來源

登錄GeneCards人類基因數據庫[4]（網址https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，網址https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）數據庫[5]、國際遺傳藥理學數據庫（PharmGkb）（網址https：//www.pharmgkb.org），設置搜索條目為關鍵詞搜索。搜索條目下以“Cholecystitis、Calculous cholecystitis”為關鍵詞篩選，設置物種為人，獲取結石性膽囊炎相關的疾病靶點。對3個數據庫檢索到的疾病靶點進行合并去重，作為最終的疾病靶點來源。

1.3 獲取交集基因與化學成分-靶點網絡圖的構建

選擇R軟件，安裝Draw Venn Diagrams程輯包，運行以獲得交集基因靶點作為大柴胡湯治療結石性膽囊炎的潛在作用靶點并繪制韋恩圖。將獲取到的交集基因導入網絡可視化軟件Cytoscape 3.8.0，構建化學成分-靶點作用網絡。對網絡進行分析，以度值參數作為評價節點在網絡中重要性的標準。

1.4 大柴胡湯治療結石性膽囊炎的蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及核心蛋白篩選

人類生命體蛋白質之間存在著相互作用的直接或間接聯系。為觀察大柴胡湯治療結石性膽囊炎的蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）以及篩選核心蛋白，登錄String數據庫（網址https：//string-db.org/），選擇Multiple proteins，在搜索條目下輸入獲取到的交集基因，限定物種為Homo Sapiens，其余設置保持不變，構建PPI功能網絡，并繪制網絡圖。為篩選核心蛋白，將STRING數據庫得到的string_interactions.txt文件導入Cytoscape 3.8.0，應用Network Analyse插件構建網絡，選擇CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，篩選網絡中的關鍵節點。核心蛋白篩選參數：Betweenness Centrality，Closeness Centrality，Degree Centrality，Eigenvector Centrality，Local Average Connectivity-based method。篩選條件：應用R軟件的在線程輯包，對交集基因下的Betweennes Centrality、Closeness Centrality、Degree Centrality、Eigenvector Centrality、Local Average Connectivity-based method數值進行測算，各組數值中大于本組中位值的基因予以保留，運行2次R腳本，篩選核心蛋白基因。應用CytoHubba插件計算構建的網絡的Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC數值，并對計算過的數值基因進行可視化處理。

1.5 基因本體和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

基于R語言對獲取到的交集基因進行富集分析。在R語言中Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）網站安裝所需要的Biocmanager，org.Hs.eg.db，Colorspace，Stringi，ggplot2，DOSE，ClusterProfiler，enrichplot，Pathview等程輯包。首先將基因Symbol轉化為基因ID，選擇物種為人（Homo spanies），設定閾值為P<0.05，輸出基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集結果并繪制條形圖與氣泡圖。

1.6 分子對接驗證

登錄Pubchem數據庫（http：//zinc.docking.org/）查詢“1.3”中大柴胡湯關鍵成分結構，保存格式選擇為mol并優化結構。登錄PDB蛋白質結構數據庫（http：//www.rcsb.org/），搜索“1.4”中篩選出的核心交集基因蛋白，下載核心蛋白的3D結構，保存格式選擇PDB。使用PyMol軟件刪除蛋白質結構的水分子和小分子配體，并導入AutoDockTools進行加氫等預處理，將有效成分和核心蛋白均轉換成pdbqt格式文件。運行AutoDockTools對有效成分和核心蛋白分別進行對接，保存最低結合能數據作為分子對接的結果。結合能越低，表明活性成分與靶蛋白的結合力越強。一般認為結合能≤-5.0 kJ/mol的藥物分子與靶點具有較好的結合活性。

2 結果

2.1 復方化學成分及藥物靶點

本研究共收集大柴胡湯藥物化學成分151個，其中數據庫收集151個;中藥預測靶點1 190個，合并去重后收集260個，通過UniProt數據庫對藥物靶基因進行校正，使其名稱格式標準化。大柴胡湯各中藥化學成分及預測靶點數量見表1。

2.2 疾病靶點的獲取

在GeneCards、OMIM-NCBI、PharmGkb數據庫中以“Cholecystitis、Calculous chole-cystitis”為關鍵詞進行檢索，經合并去重共獲得485個候選靶標。

2.3 獲取復方-疾病交集基因

基于R語言3.6.0，在R語言中Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）網站安裝VennDiagram程輯包，運行程序獲取交集基因并繪制韋恩圖。見圖1。共獲得復方-疾病交集基因55個，交集基因見表2。

2.4 構建有效成分-靶點網絡圖

運用Cytoscape 3.8.0中Import Network插件構建復方有效化學成分-靶點作用網絡。見圖2。復方有效化學成分見表3。網絡共有123個節點，357條邊。方形代表交集基因，三角形代表有效化學成分?；瘜W成分所屬藥物用顏色顯示，其中綠色代表柴胡，草綠色代表黃芩，淺紅色代表大黃，淺藍色代表大棗，深藍色代表半夏，紫色代表枳實，紅色代表白芍，生姜所含有效成分被共有化學成分所覆蓋。網絡中化合物與靶點的關系用每條邊來顯示。網絡圖說明大柴胡湯治療結石性膽囊炎的過程是多成分、多靶點起效的復雜網絡，這也與中藥作用的復雜性不謀而合。

2.5 核心PPI網絡構建及核心蛋白篩選

對交集基因初步構建PPI網絡見圖3。網絡圖包括57個節點，551條邊。節點代表蛋白質，邊代表蛋白質與蛋白質之間的作用關系。網絡連接程度越高說明蛋白質之間關系越密切。篩選核心蛋白基因，核心蛋白見表4（按度值排列前20的蛋白）。篩選流程見圖4。計算構建網絡的Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC數值，按數值的大小進行同心圓排列，數值越大顏色越深且位于中心位置。見圖5。

2.6 交集基因的GO功能富集分析

基于R軟件3.6.0對大柴胡湯治療結石性膽囊炎的55個作用靶點進行GO功能富集分析。富集內容包括細胞組分，生物過程，分子功能。富集條件為P≤0.05且Q≤0.05。通過分析發現，富集到了2 307個GO條目。細胞組分92個，主要有膜筏、膜微區、膜區、囊腔、胞質小泡腔、小凹、質膜筏、分泌顆粒腔、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物等。生物過程2 126個，主要涉及腺體發育、氧化應激反應、對營養水平反應、細胞對氧化應激反應、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調控、對金屬離子的反應、活性氧代謝過程、對活性氧的反應、細胞對活性氧的反應、對鎘離子的響應等。分子功能89個，主要有受體配體活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合、磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合、生長因子活性、激素受體結合、抗氧化活性、蛋白酶結合、組蛋白乙酰轉移酶結合等。選取各排名前10的富集條目，繪制條形圖。見圖6。

2.7 交集基因的KEGG通路富集分析

基于R語言的“Pathview”在線程輯包，對交集基因進行KEGG通路富集分析。分析結果發現，55個復方-疾病交集基因共富集到了150條通路（P<0.05），主要涉及AGE-RAGE信號通路、白細胞介素-17信號通路、HIF-1信號通路。選取富集基因數目前20的通路進行可視化處理，顏色表示通路富集到的數目，數目越大顏色越偏向紅色，數目越小則越偏向藍色。見圖7。各通路富集基因數目所占百分比見圖8。

2.8 分子對接分析

通過有效成分-靶點網絡圖顯示，槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、柚皮素（MOL004328）、β-谷甾醇（MOL000358）是大柴胡湯治療結石性膽囊炎的有效化學成分。通過PPI網絡分析，TNF-α、CCK、EGFR、AKT1、VEGFA是大柴胡湯治療結石性膽囊炎的核心蛋白。將有效化學成分與核心蛋白進行分子對接，結果顯示，TNF-α與槲皮素、木犀草素、柚皮素;CCK與槲皮素、β-谷甾醇;EGFR與槲皮素、木犀草素;AKT1與槲皮素、木犀草素、柚皮素;VEGFA與槲皮素、木犀草素均有較好的結合活性。大柴胡湯中的槲皮素、木犀草素等核心有效成分能夠與TNF-α、CCK等核心蛋白發生相互作用，治療結石性膽囊炎。分子對接結果見表5，圖9。

3 討論

中醫并無膽囊炎的記載，但根據其發作時引起右上腹劇烈疼痛，伴有黃疸等臨床特征，將其歸為“脅痛”“膽脹”“黃疸”等范疇，多因飲食不節，損傷脾胃，情志不暢，肝氣郁結，導致濕熱內蘊，肝膽瘀滯而發病[6]。大柴胡湯是《傷寒雜病論》中表里雙解的代表方劑，具有和解少陽，內瀉熱結的作用[7-8]?，F代藥理學研究顯示，大柴胡湯復方能通過保肝、利膽、抗血小板聚集、抑制離體平滑肌來治療膽石癥[9]。黃敏等[10]發現大柴胡湯能調整黃疸大鼠MRP2蛋白的表達，加速膽汁和膽紅素的排泄，促進膽汁的排出，改善黃疸癥狀的功效。徐迎濤和孫雪萍[11]發現加味大柴胡湯可明顯降低血漿WBC數目及膽囊局部TNF-α含量。在臨床上大柴胡湯被廣泛應用于膽囊炎的治療。

本研究基于網絡藥理學的方法[12]，研究大柴胡湯治療膽囊炎的作用機制。結果表明，槲皮素（MOL000098 quercetin）、β-谷甾醇（MOL000358 beta-sitosterol）、木犀草素（MOL000006 luteolin）、柚皮素（MOL004328 naringenin）等是其主要的化學成分。既往的研究表明，槲皮素是一種能夠有效抑制腫瘤壞死因子和白細胞介素等炎癥介質表達的黃酮類化合物，在抗氧化、消炎鎮痛等方面療效顯著[13-15]。劉威良等[16]、肖志彬等[17]發現β-谷甾醇具有類激素樣抗炎的作用并能夠降低機體內腫瘤壞死因子水平。木犀草素能調控炎癥反應，抑制IL-6、IL-1B、TNF-α等炎癥介質的表達[18]。柚皮素作為一種黃烷酮類物質，具有較強的抗炎及抗氧化作用。邱琦等[19]研究發現，柚皮素可以激活P13K/AKT信號通路，增加SOD的活性，提高細胞的增殖率。在大柴胡湯的主要化學成分里，槲皮素主要來源于柴胡、大棗。β-谷甾醇主要來源于大黃、黃芩、半夏、白芍、大棗、生姜。木犀草素、柚皮素主要來源于枳實。這說明，大柴胡湯可能是通過多味中藥中的槲皮素，β-谷甾醇，木犀草素，柚皮素等主要化學成分來限制腫瘤壞死因子等炎癥介質的高表達，降低膽囊局部炎癥反應，增加膽囊收縮運動來達到治療膽囊炎的目的。

核心蛋白篩選結果顯示，TNF-α（腫瘤壞死因子）、CCK（膽囊收縮素）、EGFR（表皮生長因子受體）、AKT1（AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1）、VEGFA（血管內皮生長因子A）的Degree值較大，在網絡中連接程度較高。TNF-α是一種多態性激素，是機體炎癥及免疫反應與增強單核細胞活力的重要調節因子，參與機體多種局部和全身的炎癥反應[20]。當機體局部TNF-α含量增加時，可以刺激機體分泌IL-1，IL-6等炎癥介質，介導炎癥反應，也可作為內源性致熱源引起發熱[21]。當結石性膽囊炎發病時，機體內TNF-α含量升高，膽囊局部發生炎癥反應，引起發熱。膽囊局部的炎癥反應是引起膽囊炎發病的重要基礎，當膽囊炎發生時，機體釋放大量的TNF-α，引起發熱，膽囊局部滲出增多，發生右上腹疼痛。CCK作為一種人體分泌的腦腸肽激素，能促進膽囊的收縮運動以利膽，促進膽汁排泄;降低食管括約肌張力，抑制胃排空[22]。機體內的CCK含量降低，導致膽囊運動功能障礙，膽汁排泄障礙，淤積于膽囊內易形成結石，導致結石性膽囊炎發病。大柴胡湯中的有效化學成分可以作用于機體中CCK受體，調節膽囊的收縮運動，達到治療結石性膽囊炎的目的。EGF是EGFR主要配體之一，能夠刺激周圍神經修復和再生[23]。另外，Daniela M[24]研究發現EGFR可以通過促進配體EGF的高表達來促進血管淋巴管的再生，刺激周圍神經的修復和再生。當結石性膽囊炎發病時，會造成膽囊局部發生炎性病變，局部淋巴管及血管通透性受阻。大柴胡湯通過作用于EGFR以介導炎癥反應，修復受損的周圍神經及血管來達到治療結石性膽囊炎的目的。AKT又稱PKB（Protein Kinase B），是絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞的生長及凋亡中起到重要作用。AKT1作為AKT的亞型之一，廣泛表達于人體各個組織，參與了細胞的成活及生長調控[25]。AKT1可能是通過提高細胞因子活性促進膽囊局部病變細胞的凋亡來達到治療膽囊炎的目的。VEGFA是血管內皮生長因子（VEGF）的一個亞型，通過誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移并抑制凋亡，在血管生成及內皮細胞生長中扮演著重要角色[26]。結石性膽囊炎發病時導致膽囊系統發生炎癥反應，嚴重時局部缺血缺氧，甚者出現微血管血栓形成，發生微循環障礙。VEGFA能促進血管生成，從而改善膽囊炎癥時的局部缺血缺氧狀態，以緩解疼痛，抑制炎癥，達到治療疾病的目的。

交集基因KEGG通路富集分析，其通路主要包括AGE-RACE信號通路、HIF-1信號通路、白細胞介素-17信號通路等。既往的研究表明，楊超茅等[27]發現AGE-RACE信號通路能夠激活逆轉錄因子核因子κB（Nuclear Factor-κB），從而使得細胞核表達和釋放大量的黏附因子、生長因子、炎癥介質（白細胞介素-6，腫瘤壞死因子-α）等，從而導致機體損傷。核因子κB又可以增強AGE-RACE信號通路的表達，使得該通路能夠持久作用于細胞[28]。HIF-1是介導機體對缺氧環境適應性反應的關鍵轉錄激活因子，能夠隨著細胞中氧濃度的變化而改變基因表達[29]。局部炎癥反應是膽囊炎病變的基礎，有效地控制炎癥對治療膽囊炎具有明顯的促進作用。在膽囊炎的發生發展過程中會釋放大量的炎癥介質，IL-17信號通路能夠調控IL-4、IL-6、TNF-α、COX2等炎癥介質，阻斷IL-17信號通路能夠有效抑制炎癥介質的釋放，達到治療疾病的目的。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學的方法，分析大柴胡湯治療膽囊炎的機制。結果顯示，大柴胡湯治療膽囊炎主要是通過槲皮素、β-谷甾醇等多種潛在化學成分作用于腫瘤壞死因子、膽囊收縮素、表皮生長因子受體、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1等基因，從而調節多種生物學功能以及多條通路來達到治療目的。本研究為后續進一步探討機制和優化實驗設計提供支持，同時，本研究也為中藥及其復方治療某種疾病的機制分析提供了研究方法。

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（2020-12-09收稿 本文編輯：楊燕）