懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析

尹明華 陳佳雯 陳瑞 樊凡 辜婷婷 何思捷 陳榮華 蔡紅

摘要：通過懷玉山三葉青試管苗轉錄組數據庫篩選到懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因的核心片段，利用RT-PCR 技術克隆該病毒增殖蛋白3基因，并進行序列分析、亞細胞定位、器官表達分析和功能分析。結果表明：懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA總長度為873 bp，G+C 含量為44.22%;懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3由290個氨基酸組成，分子量33 374.79 u，等電點9.72，為疏水性蛋白;二級結構由α-螺旋（57.24%）、β-片層（10.69%）、無規則卷曲（32.07%） 構成;三級結構為單體;預測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3主要存在質膜、液泡膜、內質網中;懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3與葡萄煙草病毒增殖蛋白3 （GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1）的同源性最高，同源性達到94.83%。通過煙草葉片亞細胞定位分析表明，煙草病毒增殖蛋白3定位于細胞質（可能包括細胞膜）和細胞核膜中。實時定量PCR結果顯示，煙草病毒增殖蛋白3基因在懷玉山三葉青2個栽培種中的表達存在器官特異性，懷玉2號和懷玉1號均在葉中表達量最高;煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草的三葉青花葉病毒表達量顯著高于煙草病毒增殖蛋白3轉基因陰性煙草;與煙草病毒增殖蛋白3轉基因陰性煙草相比較，煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學量子效率（ΦPS Ⅱ）、光化學淬滅系數（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著下降，而非光化學淬滅系數（NPQ）顯著上升。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3具有典型煙草病毒增殖蛋白3的結構特征，氨基酸序列及核酸序列與同源物種相似度高，進化上高度保守，且可促進三葉青煙草花葉病毒的增殖，降低植株的光合作用效率。

關鍵詞：懷玉山三葉青;煙草病毒增殖蛋白3;基因克隆;功能分析;蛋白結構

中圖分類號：S567.901 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）06-0032-09

收稿日期：2021-04-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31960079）;江西省重點研發計劃一般項目（編號：20192BBGL70050、20202BBG73010）;江西省教育廳科學技術研究項目（編號：GJJ201704）;上饒市重點研發計劃一般項目（編號：2020C002）;上饒市平臺載體建設項目（編號：2020J001、2019I017）。

作者簡介：尹明華（1973—），江西永新人，女，碩士，教授，主要從事植物生物技術研究工作。E-mail：yinminghua04@163.com。

三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）是我國特有珍稀瀕危藥用植物，別稱三葉青、金線吊葫蘆、蛇附子、石老鼠，為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬（Tetrastigma）多年生蔓生藤本[1]。三葉青全草均可入藥，以地下塊根和果實的藥用效果最好[2]?，F代醫學研究表明，三葉青對于高熱、肺炎、肝炎、胃炎等諸多嚴重感染性疾病均有顯著療效[3]。另外，三葉青所含的三葉青黃酮、β-谷甾醇、多糖等能很好地抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，且無毒無副作用，是目前公認的“植物抗生素”[4]。三葉青一般采用扦插無性繁殖，極易感染和積累煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）[5]。煙草花葉病毒是一種單鏈RNA病毒，寄主范圍廣，能侵染茄科、葫蘆科、豆科、十字花科、藜科、莧科、番杏科和商陸科等 30 科 300 多種植物。TMV 侵染植物后葉片常表現為表面斑駁、泡斑、畸形、壞死等癥狀，對農業生產造成嚴重危害[6]。煙草花葉病毒在宿主體內的復制和運輸需要依靠一些宿主因子才能完成[7]。 近年來在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中一些宿主因子基因陸續被發現，并被證實支持病毒的復制，如煙草病毒增殖蛋白1（tobamovirus multiplication 1，TOM1）、煙草病毒增殖蛋白2 （TOM2）和煙草病毒增殖蛋白3 （TOM3）[8]。因此，克隆三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因并對其進行功能分析，對研究煙草病毒增殖蛋白3基因在三葉青中的表達和三葉青煙草花葉病毒的增殖具有重要意義。關于煙草病毒增殖蛋白3研究的報道較少。宋靜靜等構建了馬鈴薯StTOM1和 StTOM3雙干擾植物雙元表達載體并對其進行了轉化驗證，StT1-StT3 馬鈴薯中StTOM1基因 mRNA的表達水平下調了 78%，StTOM3基因下調了 81%[9]。目前，對三葉青的研究主要集中在化學成分、藥理臨床、種植栽培、組織培養等方面[10]，關于三葉青煙草病毒增殖蛋白3方面的研究尚未見報道。利用RT-PCR 技術克隆懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因，并采用生物信息學方法、煙草轉基因技術和實時定量 PCR進行序列、功能和組織表達分析，為揭示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3的生物學功能提供理論依據，為從分子水平調控懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷玉山三葉青2個栽培種懷玉1號和懷玉2號試管苗。試驗于2020年8月至2021年3月在上饒師范學院生命科學學院進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第1鏈合成 用Trizol 試劑提取懷玉2號試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照 M-MLV cDNA 第1鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第1鏈。逆轉錄引物用 Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進行。

1.2.2 煙草病毒增殖蛋白3基因的克隆 利用轉錄組組裝的Unigene序列信息（TRINITY_DN3523_c0_g1），運用 Primer Premier 5.0 設計引物（F：ATGGCGCCGACGGCAGAGGTAG;R：GCGAATAGGATGATATTGTGTGAT）。PCR反應體系（總體積50 μL）包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix（各10 mmol/L）、2 μL 模板DNA、2 μL引物1（10 μmol/L）、2 μL 引物2（10 μmol/L）、1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease（1 U/μL）。PCR擴增條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s，45～55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，39個循環;72 ℃ 5 min。PCR 產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉化到感受態細胞Escherichia coli DH5α，經鑒定正確的陽性轉化子提取質粒送往生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.2.3 煙草病毒增殖蛋白3基因的生物信息學分析 使用 BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列，用 ProtParam預測酶的理化性質，用 ProtScale預測酶的疏/親水性。使用GOR I軟件在線預測酶的二級結構。使用SWISS-MOLD在線預測酶的三級結構。采用 WoLFPsort在線預測基因的表達部位。通過軟件DNAMAN和 Bioedit進行氨基酸序列比對，利用MEGA5.0軟件進行系統進化樹的構建。

1.2.4 載體構建 用BamHⅠ酶切載體pRI101-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應。酶切反應體系包括4 μL 10×K/10×L Buffer、5 μL 載體質粒、2 μL BamHⅠ和ddH2O（補足至40 μL）。酶切產物純化后與上述PCR產物進行重組反應。重組連接反應體系（總體積10 μL）包括4 μL 線性化載體、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddH2O（補足至10 μL）。重組產物轉化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉化子搖菌培養提取質粒，同時擴增產物送測序。擴增和測序引物為插入目的基因兩側的載體序列，分別為 35S-F：5′-GACGCACAATCCCACTATCC-3′;GFP-JR：5′-GGGTGAGCTTGCCGTAGGTG-3′。

1.2.5 煙草葉片亞細胞定位 將構建好的載體質粒轉入農桿菌GV3101，涂布卡那霉素抗性平板，挑取單克隆于YEB液體培養基，在28 ℃搖床內小搖、大搖培養2 d，菌體4 000 r/min離心4 min，去上清后菌體用10 mmol/L MgCl2（含120 μmol/L乙酰丁香酮）懸浮液重懸，調整D600 nm值至0.6左右;用無針頭的1 mL注射器吸取農桿菌菌液，從煙草葉片下表皮（背面）壓迫注射;將注射完成的煙草植株弱光培養2 d，即可觀察。接種2 d后取注射區域的煙草葉片，制作玻片，在激光共聚焦顯微鏡（FluoView FV1Oi，OLYMPUS公司）下觀察、拍照;同時以空載體轉化的農桿菌作為對照重復上述操作。葉綠體熒光信號說明：葉綠體熒光信號激發波長640 nm，發射波長675 nm;綠色熒光蛋白（GFP）信號說明：綠色熒光蛋白GFP激發光488 nm，發射光510 nm。

1.2.6 煙草病毒增殖蛋白3轉基因株系PCR檢測 煙草葉片用農桿菌侵染后均經過4次篩選/繼代，誘導出抗性芽，再轉入伸長培養基中。采用PCR對其再生苗進行鑒定，得到煙草病毒增殖蛋白3基因的煙草轉基因株系。PCR擴增體系（共20 μL）包括7 μL ddH2O、10 μL 2×Taq Master Mix、1 μL 模板DNA、1 μL引物1（10 μmol/L）、1 μL引物2 （10 μmol/L）。PCR反應程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環;72 ℃ 5 min。

1.2.7 煙草病毒增殖蛋白3轉基因株系和非轉基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標檢測 培養3個月后，取含煙草花葉病毒的三葉青試管苗葉片放在研缽中并加入適量磷酸緩沖液研磨成糊狀病樣汁液;然后在煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性株系和陰性株系移栽苗幼嫩的葉面上撒少許等量金剛砂，蘸取含煙草花葉病毒的煙草試管苗等量病樣汁液在撒了金剛砂的葉面上輕抹 3次（模擬蚜蟲的病毒田間傳播），之后用無菌水清洗葉面;然后放入智能人工氣候室內澆灌MS液體培養基培養;2個月后采用林國衛等的方法[5]對三葉青煙草花葉病毒在煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性株系和陰性株系上的表達量進行qRT-PCR檢測，同時采用Li-6400便攜式光合測定儀（LI-COR公司，美國）測定煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性株系和陰性株系移栽苗的光合參數和葉綠素熒光參數。所有數據均表示為平均值±標準差，并使用SPSS19.0軟件進行統計分析，應用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗差異顯著性（α=0.05）。

1.2.8 煙草病毒增殖蛋白3基因的組織表達分析??? 分別取懷玉1號和懷玉2號試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng，反轉錄為cDNA。熒光定量 PCR（qRT-PCR，SYBR GreenⅠ）檢測內參基因為GAPDH。設計引物（F：CCTATCCCAGTCACGGTCAT;R：ACAGGGAAGCGTTGTAGCA）。qRT-PCR 檢測采用 20 μL 反應體系，PCR反應程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s，51 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40個循環。使用 2-ΔΔCT 法計算基因表達水平。試驗重復3次。所有數據均表示為平均值±標準差，并使用SPSS19.0軟件進行統計分析，應用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗煙草病毒增殖蛋白3基因組織表達的差異顯著性（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA序列

通過PCR擴增技術（圖1），懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA總長度為873 bp，G+C 含量為44.22%（圖2）。

2.2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3氨基酸序列

Protparam預測的懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3氨基酸序列見圖3。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3由290個氨基酸組成，分子量為33 374.79 u，等電點9.72，為疏水性蛋白。各氨基酸的數目和比例為Ala（A）（26，9.0%）、Arg（R）（17，5.9%）、Asn（N）（9，3.1%）、Asp（D）（6，21%）、Cys（C）（4，1.4%）、Gln（Q）（11，3.8%）、Glu（E）（9，3.1%）、Gly（G）（11，3.8%）、His（H）（6，2.1%）、Ile（I）（22，7.6%）、Leu（L）（38，131%）、Lys（K）（10，3.4%）、Met（M）（5，1.7%）、Phe（F）（24，8.3%）、Pro（P）（13，4.5%）、Ser（S）（12，4.1%）、Thr（T）（14，4.8%）、Trp（W）（8，28%）、Tyr（Y）（12，4.1%）、Val（V）（33，11.4%）。帶負電殘基總數（Asp+Glu）為15，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為27。序列的N端為M（Met），C端為R（Arg）。失穩指數（Ⅱ）計算為40.09，該蛋白質為不穩定蛋白質。

2.3 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3親疏水性

從圖4可知，高峰值（正值）的區域表示疏水的區域，而低谷值（負值）的區域是親水區域。結果表明，最大疏水值為3.0左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強;親水峰最大值為-3.0左右，在該多肽中說明該處的親水性最強。整個蛋白質表現出高度的疏水性，說明該蛋白為疏水性蛋白質。

2.4 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3二級結構

GOR 預測顯示其二級結構由α螺旋（Hh，5724%）、β-片層（Ee，1069%）、 無規則卷曲（Cc，32.07%）構成（圖5）。從分布位點來看，C端和N端含無規則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規則卷曲、β-片層和α-螺旋則散布于整個蛋白質中。

2.5 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3三級結構

SWISS-MODEL預測顯示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3的三級結構為單體（圖6）。

2.6 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3亞細胞定位預測

采用 WoLFPsort在線軟件對懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因的表達部位進行預測（圖7），結果表明，定位于質膜中的數量為8，液泡膜中為4，內質網中為1，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因主要存在質膜、液泡膜和內質網中。

2.7 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3系統進化分析

通過Blastp比對取同源性最高的全15個蛋白，從構建的進化樹（圖8）可見，懷玉山三葉青與Herrania umbratica（哥倫比亞錦葵）、Durio zibethinus（榴蓮）、Carica papaya（番木瓜）、Tripterygium wilfordii （雷公藤）、Pistacia vera（開心果）、Punica granatum（石榴）、 Nelumbo nucifera（蓮）和Vitis vinifera（歐亞種葡萄）、Vitis riparia（河岸葡萄）在一個大分支下，說明在進化上親緣關系較近，尤其是與Vitis vinifera（歐亞種葡萄）、Vitis riparia（河岸葡萄）煙草病毒增殖蛋白3（GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1）在同一小分支下，說明兩者在進化上具有最高的親緣關系。

2.8 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3同源蛋白的序列比對信息

比對結果見圖9，其中※號區域是該蛋白家族的保守結構域。

2.9 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因目的片段擴增與瞬時表達載體構建

以提供的目的基因序列設計引物（去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA）進行PCR擴增。將PCR產物進行凝膠電泳。結果顯示，在目標位置擴增到單一條帶，大小正確。將條帶切膠回收，即為目的基因片段（圖10）。用BamHI酶切載體pRI101-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應。重組產物轉化大腸桿菌DH5α細胞。挑取PCR陽性的轉化子搖菌培養提取質粒，對重組質粒進行酶切檢測，同時擴增產物送測序。測序比對結果顯示，目的基因已插入載體，表達載體構建準確（圖11）。

2.10 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3亞細胞定位分析

通過煙草葉片瞬時表達，將煙草病毒增殖蛋白3融合綠色熒光蛋白（GFP）的載體質粒2301-TP2A-GFP轉入農桿菌，吸取農桿菌液，壓迫注入煙草葉片下表皮（背面）進行煙草病毒增殖蛋白3亞細胞定位分析（圖12）。利用激光共聚焦顯微鏡觀察，融合GFP的煙草病毒增殖蛋白3轉化煙草葉片只在細胞質（可能包括細胞膜）和細胞核膜觀察到綠色熒光，表明煙草病毒增殖蛋白3定位于細胞質（可能包括細胞膜）和細胞核膜，與 WoLFPsort在線軟件預測結果基本一致。

2.11 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉基因煙草鑒定、GUS組織化學染色和光合特征

圖13為煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草和陰性煙草PCR檢測，通過PCR檢測篩選出煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草和陰性煙草。由圖14可見，懷玉山三葉青煙草花葉病毒侵染后，煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草根莖葉的TMV表達量顯著高于轉基因陰性煙草。光合生理的測定結果表明，與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學量子效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數（qP）及電子傳遞效率（ETR）顯著下降，而非光化學淬滅系數（NPQ）顯著上升（表1）。

2.12 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中煙草病毒增殖蛋白3基因的表達分析

以懷玉山三葉青的GAPDH為內參，利用實時熒光定量PCR分析懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因在懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中的表達情況。結果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因在根、莖、葉中均有表達，但在不同組織器官的表達情況差異顯著（圖15），但均在葉中表達量最高。

3 結論與討論

煙草花葉病毒侵染宿主后，需要依靠宿主內一些病毒增殖蛋白（如TOM1、TOM2和TOM3）才能完成其自身的復制[9]。研究表明，在擬南芥、煙草、番茄、辣椒等植物中TOM1和TOM3基因可以促進TMV、CMV、ToMV等病毒的復制，說明TOM1和TOM3基因在不同物種之間存在一定的保守性[11]。宋靜靜克隆了馬鈴薯StTOM3基因的cDNA和基因組DNA序列，獲得的cDNA長度為 1 254 bp，全長基因組DNA長度為6 245 bp[11]。StTOM3基因含有多個高疏水性區域，為7次跨膜蛋白。馬鈴薯StTOM3基因編碼297個氨基酸，與擬南芥StTOM3基因在核苷酸水平上的同源性為612%，在氨基酸水平上同源性達到72.9%，相似性達到83.8%[12]。番茄基因ToTOM3全長cDNA共有1 267個核苷酸，包含1個含888個核苷酸的編碼區、72個核苷酸的5′非編碼區和307個核苷酸的3′非編碼區，編碼1個含295個氨基酸、推測是一種7次跨膜蛋白的分子量為34.4 ku的蛋白質[13]。本試驗結果表明，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因cDNA總長度為873 bp，G+C 含量為44.22%，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3由290個氨基酸組成，分子量為33 374.79 u，等電點為9.72，為疏水性蛋白。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3在進化上與Herrania umbratica（哥倫比亞錦葵）、Durio zibethinusl（榴蓮）、Carica papaya（番木瓜）、Tripterygium wilfordii （雷公藤）、Pistacia vera（開心果）、Punica granatum（石榴）和 Nelumbo nucifera（蓮）和Vitis vinifera（歐亞種葡萄）、Vitis riparia（河岸葡萄）的親緣關系較近，尤其是與Vitis vinifera（葡萄）煙草病毒增殖蛋白3（GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1）在進化上具有最高的親緣關系。說明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因具有保守性。這些保守區段的發現將為其他物種新的懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因的克隆提供序列依據。從堿基組成和G+C含量基本平衡來看，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因G+C的含量越高，基因穩定性越高，三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因基本處于穩定狀態，這可能為三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因穩定遺傳與進化提供了保證。

本研究表明，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3在氨基酸序列水平上除了與 TOM3-like、TOM3 isoform X2和TOM3 isoform X1具有較高的同源性，還與Herrania umbratica（哥倫比亞錦葵）、Durio zibethinusl（榴蓮）等其他植物中一些未知功能的跨膜蛋白具有高度同源性，暗示許多植物中可能存在類似的功能蛋白（在此稱之為 TOM 家族）參與病毒復制過程中 RNA 復制復合體的裝配、特異選擇和招募 RNA 復制模板、激活 RNA的合成等[14-18]，或是與運動蛋白或胞間連絲相互作用，參與病毒的體內運輸[19-22]。這些 TOM 膜蛋白很可能作為病毒復制酶的一種框架結構，同時還可以作為病毒蛋白和其他寄主因子的錨定物參與病毒復制復合體的形成[23-25]。

研究表明，擬南芥TOM1和TOM3 基因均編碼跨膜蛋白，其同源性為 56%，主要與 TMV 復制蛋白中的螺旋酶相互作用，幫助復制酶復合體錨定在內質網膜或液泡膜等高密度生物膜上[26]。本試驗通過軟件預測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3主要存在質膜、液泡膜、內質網中;而煙草葉片亞細胞定位分析表明，煙草病毒增殖蛋白3定位于細胞質（可能包括細胞膜）和細胞核膜中。本試驗結果與前人的研究結果一致。Kumar等認為與液泡膜相關的宿主蛋白TOM1和TOM3是煙草病毒高效增殖所必需的[27]。有研究表明，轉反義ToTOM3或RNAi的番茄植株推遲發病時間并且癥狀顯著減輕，生物學測定結果表明轉反義ToTOM3或RNAi的轉基因番茄植株顯著抑制CMV和TMV在番茄體內的積累，證實番茄ToTOM3基因是CMV和TMV的寄主因子基因[13]。

在本試驗中，懷玉山三葉青煙草花葉病毒侵染后，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草根莖葉中的懷玉山三葉青TMV表達量顯著高于轉基因陰性煙草。表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3可以促進懷玉山三葉青煙草花葉病毒的增殖，也證明懷玉山三葉青ToTOM3基因是懷玉山三葉青煙草花葉病毒的寄主因子基因。

馬鈴薯ToTOM3基因在馬鈴薯的基因組中為單拷貝基因，且在馬鈴薯營養生長和生殖生長時期的各個器官內都有表達[11]。相對定量RT-PCR試驗表明ToTOM3基因在番茄子葉期、5葉期、10葉期、結果期等4個生育期的莖、根、葉及結果期的花、果等組織中均有表達，而且表達量基本一致，說明ToTOM3屬于組成型表達基因[13]。本試驗結果與此不同，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因在根、莖、葉中均有表達，但在不同組織器官中的表達情況差異顯著，在葉中表達量最高。表明，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3基因主要的表達位置在葉片。植物病毒一旦侵染會導致植物種性退化，產量下降，品質變劣。究其原因是植物的無性繁殖極易感染，從而使植物的光合效率下降[28]。在本試驗中，與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3轉基因陽性煙草的凈光合速率、氣孔導度、蒸騰速率、最大光化學效率、實際光化學量子效率、光化學淬滅系數及電子傳遞效率顯著下降，而非光化學淬滅系數顯著上升，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白3通過懷玉山三葉青煙草花葉病毒的增殖繼而影響植株的光合作用，這是植物產量下降、品質變劣的根本原因。本研究首次從懷玉山三葉青基因組中克隆出煙草病毒增殖蛋白3基因，并對克隆的基因序列和其氨基酸序列進行了生物信息學、亞細胞定位以及功能和組織表達分析，為三葉青煙草花葉病毒增殖的研究補充了基礎資料。同時，由于煙草花葉病毒的復制和維持需要合適的寄主因子，通過調控寄主因子，阻斷煙草花葉病毒在懷玉山三葉青體內的復制和運輸，就有可能達到防治煙草花葉病毒病和減輕病害癥狀的目的。這種策略對懷玉山三葉青煙草花葉病毒病的防治具有普遍意義，是最有希望的新的抗懷玉山三葉青煙草花葉病毒策略之一。

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