百菌清對楊樹爛皮病的抑制機理初步分析

紀純陽

（遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213）

楊樹作為主要的造林樹種，在遼寧省內栽培廣泛，品種多樣[1]。近些年，因受自然因素和人為因素的影響，導致楊樹用材林和防護林病蟲害發生嚴重，直接影響楊樹產業的發展[2-3]，如何安全有效的防治楊樹病蟲害，仍是目前需要深入研究的課題。

楊樹爛皮病是楊樹重要的枝干病害之一[4]，病原菌無性階段為金黃殼囊孢菌Cytospora chrysosperma（Pers.）Fr.，有性階段為污黑腐皮殼Valsa sordidaNit.[3,5]。楊樹生長過程中發生凍害、日灼、干旱等自然災害時，就會引起楊樹樹勢衰弱、干部創傷，爛皮病大面積發生，甚至枯死，嚴重時造成楊樹大片死亡[6-7]。通常采用化學農藥來防治楊樹爛皮病，而且抑制機理研究報道很少。本研究選用了一種保護型殺菌劑—百菌清，初步分析其對楊樹爛皮病病原菌的抑菌機理，為楊樹爛皮病病害科學防治提供一定的理論依據。

1 試驗材料

1.1 菌株

楊樹爛皮?。?8513），購自中國林業科學院林業菌種保存中心。

1.2 藥劑

百菌清（有效成分75%，利民化學有限責任公司），丙二醛試劑盒（南京建成A003-1），考馬斯亮藍G-250（國藥集團化學試劑有限公司），牛血清白蛋白（BioFroxx）。

1.3 培養基

基礎培養基：馬鈴薯培養基（PDA）。

2 試驗方法

2.1 百菌清對楊樹爛皮病菌絲生長量和生物量的影響試驗

2.1.1 帶藥培養基的制備

將配置好的PDA 培養基等量分裝于大三角瓶中，高壓滅菌，在無菌條件下將預先稱好的不同質量百菌清藥劑加入到冷卻至40 ℃左右的培養基中，使藥劑在培養基中最終稀釋1 000、800、600 和400倍液。固體培養基在加入藥劑后混合均勻直接倒入無菌平皿中，冷卻后封口備用。液體培養基待接種后完全冷卻備用。每組處理5次重復[8-9]。

2.1.2 接種及培養

在無菌條件下，用直徑為5 mm的打孔器在預培養菌株平面上打成圓形的菌絲片，取一片菌絲片接種于帶藥固體培養基的中間，使菌絲表面與固體培養基表面接觸，用封口膜封口，放置于25 ℃生物培養箱中倒置暗培養。當對照菌絲生長至平皿邊緣時停止生長，采用十字交叉法測量菌絲的生長直徑，并做數據統計分析[10-11]。

取兩片菌絲片接種于帶藥液體培養基中，封口并放置于25 ℃搖床中暗培養。以不加藥劑為對照組，當對照組長滿整個培養基時，終止培養，取出菌絲用無菌蒸餾水沖洗干凈，用8層紗布過濾擰干，冷凍干燥后稱量干重，并進行數據統計分析[12-13]。

2.2 百菌清對楊樹爛皮病菌絲體內丙二醛（MDA）含量的影響試驗

采用TBA 法進行MDA 含量測定。取對照和帶藥處理組的干菌絲0.1 g，加入到冷凍研缽中，再加液氮研磨成粉末狀，放于10 mL無菌離心管中，用冷生理鹽水稀釋至10 mL,4 ℃條件下2 500 r/min超低溫離心5 min，取適量上清液按照南京建成A003-1試劑盒說明書進行測定丙二醛的含量[14-15]。

2.3 百菌清對楊樹爛皮病菌絲內可溶性蛋白質含量的影響試驗

采用考馬斯亮藍G-250染色法測定菌絲內可溶性蛋白質含量[16]，以牛血清白蛋白為蛋白標準品。取對照和帶藥處理組的干菌絲0.1 g 放于冷凍的研缽中，迅速加液氮研磨成粉末狀，轉移至無菌10 mL離心管中，用冷生理鹽水稀釋至10 mL，取各樣品液0.1 mL，加入0.9 mL無菌去離子水，再加入5mL考馬斯亮藍溶液，混勻后放置2 min，以加等量無菌去離子水為對照，每組3次重復。測量各樣品OD595nm，用對照管調零，并通過蛋白標準曲線計算蛋白含量[17-18]。

3 結果與分析

3.1 百菌清對楊樹爛皮病菌絲生長及生物量的影響

楊樹爛皮病病原菌在PDA 培養基上生長比較慢，8 d 時對照菌絲長至平皿邊緣，而帶藥培養基上的菌絲幾乎向外未延伸。此時采用十字交叉法測量各組的菌絲生長直徑并進行數據統計分析。結果如表1。1 000 倍稀釋液的抑制率為78.81 %±3.46 %b，而600 倍稀釋液的抑制率為85.04 %±2.12 %ab。各組間菌絲生長直徑和抑制率在P＜0.05水平上存在顯著性差異。確定不同稀釋倍數的百菌清藥劑對楊樹爛皮病有不同程度的抑制作用。抑制率隨稀釋倍數的增加（濃度降低）而降低。

楊樹爛皮病菌在液體PDA 培養基中培養12 d時，對照組菌絲已長滿整個液體發酵培養基。結果如表1。對照組100 mL 發酵液中菌絲干重為76.08±1.89a mg，而處理組菌絲干重明顯低于對照組，800倍稀釋液處理組100 mL發酵液的菌絲干重為8.79±1.59c mg，而400倍稀釋液的為3.84±1.34e mg?？梢姴煌♂尡稊蛋倬逅巹顦錉€皮病菌絲生長及生物量都有影響，能顯著抑制菌絲的生長。

表1 百菌清對楊樹爛皮病菌絲生長及生物量的影響結果

3.2 百菌清對楊樹爛皮病菌絲體內丙二醛（MDA）含量的影響

MDA 含量是菌絲細胞膜過氧化程度的體現，MDA 含量高，說明細胞膜過氧化程度高，細胞膜受到的傷害嚴重。百菌清對楊樹爛皮病菌絲體內MDA 含量結果見圖1。爛皮病菌發酵培養12 d 后，對照組菌絲體內MDA 含量為1.10±0.19 mmol/g，800倍百菌清稀釋液的菌絲體內MDA含量為1.91±0.35 mmol/g，而400 倍百菌清稀釋液的菌絲體內MDA 含量為2.07±0.41 mmol/g。處理組的MDA 含量明顯高于對照組，并隨著藥劑的稀釋倍數的減少（藥劑濃度增大）而增多，并在P＜0.05 水平上呈現顯著性差異?？梢姉顦錉€皮病菌絲受到百菌清藥劑脅迫時，膜質過氧化程度加劇，細胞膜受到損傷，導致MDA含量增多。

圖1 百菌清對楊樹爛皮病菌絲體內丙二醛含量的影響

3.3 百菌清對楊樹爛皮病菌絲體內可溶性蛋白質含量的影響

蛋白質標準曲線：蛋白質含量（Y）與吸光值OD595（x）的回歸方程為：Y=0.006 6x+0.012 3，相關系數R2=0.998 9。根據試驗測得的各處理組OD595計算出相應的蛋白質含量。結果見圖2。爛皮病菌絲發酵培養12 d后，對照菌絲體內可溶性蛋白質含量為6.29±0.96 μg/mL，800倍百菌清稀釋液的菌絲體內可溶性蛋白質含量為1.21±0.57 μg/mL，而400倍百菌清稀釋液的菌絲體內可溶性蛋白質含量為0.33±0.14 μg/mL，處理組的可溶性蛋白質含量明顯低于對照組，并隨著稀釋倍數減小菌絲體內可溶性蛋白質含量也隨之減少?？梢姲倬迥苊黠@抑制楊樹爛皮病菌絲體內可溶性蛋白質合成，導致可溶性蛋白質含量降低。

圖2 百菌清對楊樹爛皮病菌絲體內可溶性蛋白質含量的影響

4 結論與討論

百菌清作為一種保護性殺菌劑，被廣泛應用于林木病害防治。本研究主要從百菌清對楊樹爛皮病菌絲的生長和生物量的影響，及對菌絲體內丙二醛和可溶性蛋白質含量四個方面初步分析了百菌清對楊樹爛皮病的抑菌機理。通過試驗表明，百菌清能明顯抑制楊樹爛皮病菌絲的生長和生物量；破壞菌絲細胞，使細胞膜脂質過氧化程度增大，細胞受損嚴重，導致丙二醛含量增大；能顯著抑制楊樹爛皮病菌絲體內可溶性蛋白質合成，導致體內蛋白質含量降低。

在今后試驗中，還要開展更深層次的抑菌機理研究，主要從對菌絲體內各種合成與代謝相關酶活性的影響以及分子水平進行相關研究。期待為楊樹爛皮病的防治提供科學依據，為百菌清在林業病蟲害防治中的推廣與應用提供一定的理論支持。