基于傳統知識調查和網絡藥理學的土家藥天珠散增藥組方抗腦卒中效益評價研究

祝娜　張豐榮　田華詠　李晴晴　黃秀蘭　李志勇

〔摘要〕 目的 構建土家族方劑天珠散增藥組方并探討其抗腦卒中的效益性。方法 圍繞疾病腦卒中，首先通過區域性問卷調查方法確定候選增藥范圍，然后利用網絡藥理學方法對候選藥物與疾病靶點進行分析，確定最佳新組方，再依據土家族的“主幫客信”配伍理論，對新方展開合理性評析，最后利用分子對接方法，對新方治療腦卒中的機制進行初步探究。結果 土家醫推薦與天珠散配伍抗腦卒中的藥物中，八角楓、三角風、頭暈草排名靠前;對比各候選藥物預測靶點與疾病靶點網絡拓撲參數，確定了天珠散加頭暈草為新方最佳配伍，其中天麻為主藥，延齡草為幫藥，頭暈草可兼為幫、客、信藥;新方可通過參與一氧化氮生物合成過程調控、磷酸化的正調控、對含氧化合物的反應、神經元投射維持等生物過程，對腦卒中疾病癥狀進行干預;分子對接結果顯示，該組方成分26-chloro-26-deoxycryptogenin、β-ecdysterone、ecdysterone、gastrodin、4-hydroxycinnamic acid分別與蛋白APP、IL-6、MTOR、JAK2、TLR4具有良好的結合活性。結論 天珠散配伍頭暈草具有合理性與效益性，其或可增加原方天珠散抗腦卒中效果。

〔關鍵詞〕 天珠散;腦卒中;組方優化;網絡藥理學;問卷調查;分子對接;土家藥

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.04.020

Benefit evaluation of Tujia medicine Tianzhusan added medicine prescription based on

traditional knowledge investigation and network pharmacology

ZHU Na ZHANG Fengrong TIAN Huayong LI Qingqing HUANG Xiulan LI Zhiyong

（1. School of Pharmacy， Minzu University of China， Beijing 100081， China; 2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China; 3. Institute of Ethnic Medicine of Xiangxi Prefecture， Jishou， Hunan 416000， China; 4. School of Traditional Chinese Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan， Shandong 250355， China）

〔Abstract〕 Objective To construct Tujia medicine Tianzhusan added medicine prescription and explored its effectiveness in anti stroke. Methods Focusing on stroke， firstly， the scope of candidate herbals was determined by regional questionnaire survey， and network pharmacology was used to analyze the candidate herbals and disease targets to determine the best new prescription. Then， according to the compatibility theory "Zhu Bang Ke Xin" of Tujia doctors， the new prescription was rationally evaluated. Molecular docking technology was used to explore the mechanism of the new prescription in the treatment of stroke preliminarily. Results Among the herbals recommended by Tujia doctors for the treatment of stroke with Tianzhusan， Bajiaofeng （Alangium Chinense）， Sanjiaofeng （Hedera Nepalensis） and Touyuncao （Geum Japonicum Thunb） were top ranked. By comparing the topological parameters of each candidate herbal prediction targets and disease targets network， it was determined that Tianzhusan plus Touyuncao （Geum Japonicum Thunb） was the best compatibility of the new prescription， in which Tianma （Gastrodiae Rhizoma） was the “Zhu” herbal， Yanlingcao （Trillium Tschonoskii） was the “Bang” herbal， and Touyuncao （Geum Japonicum Thunb） might act as the “Bang”， “Ke” and “Xin” herbal at the same time. The new prescription might intervene the symptoms of stroke by participating in the regulation of nitric oxide biosynthesis， the positive regulation of phosphorylation， the response to oxygenates， the maintenance of neuronal projection and other biological processes. The results of molecular docking showed that the constituents of 26-chloro-26-deoxycryptogenin， β-ecdysterone， ecdysterone， gastrodin and 4-Hydroxycinnamic acid had good binding activities with proteins APP， IL6， mTOR， JAK2 and TLR4 respectively. Conclusion Tianzhusan combined with Touyuncao （Geum Japonicum Thunb） is reasonable and effective， which may increase the effect of the original prescription Tianzhusan in the treatment of stroke.

〔Keywords〕 Tianzhusan; stroke; formula optimization; network pharmacology; questionnaire survey; molecular docking; Tujia medicine

腦卒中又稱中風或腦血管意外，是全球第二大死亡原因和第三大致殘原因[1]。據《中國卒中報告2019》報道，2019年，我國腦卒中的死亡人數約占全球腦卒中死亡人數的1/3，已經成為腦卒中終身風險最高和疾病負擔最重的國家[2]。目前，國內腦卒中的防治方法以西醫為主，同時多數卒中患者還接受中草藥或針灸治療。

天珠散由天麻（Gastrodia elata Bl.）與延齡草（Trillium techonoskii Maxim.）配伍組成，具有補虛強體、鎮靜安神、祛風散痰、補腦安神的功效，是土家族常用補腦方劑。研究表明，天珠散具有一定的抗卒中作用，能通過減輕腦組織神經細胞損傷、促進神經遞質合成，改善腦缺血大鼠的學習記憶能力[3-4]。但作為少數民族地區的民間經驗方，天珠散在口耳傳承過程當中可能存在一些配伍信息的遺漏，從而影響了其真實的藥用價值[5]。

在尊重少數民族醫藥理論經驗特征的前提下，理清配伍關系，合理增減組成以優化民族藥方劑是促進民族藥未來繁榮發展的重要方面[6]。少數民族傳統醫藥知識的挖掘和利用，需在集成已有技術、方法的基礎上創新研究思路與策略。在天然藥物研發中，以傳統醫藥知識為指引的藥物篩選模式明顯優于隨機發現模式[7]。本文采用傳統知識調查方法，挖掘整理天麻、延齡草配伍規律，嘗試在遵循土家醫藥理論經驗、原方主藥地位不變等原則[8]基礎上，構建天珠散治療腦卒中疾病的增藥新方，結合現代網絡藥理學方法與分子對接技術，確定最佳配伍，并對新方進行合理性與效益性評析。

1 資料與方法

1.1? 基于問卷調查的天麻、延齡草配伍規律研究

1.1.1? 調查對象的確定? 2019年6月28日至2019年6月30日，前往湘西吉首發放調查問卷。為保證問卷調研結果的可靠性，設置被調查者篩選條件如下：（1）所屬民族需為土家族;（2）在土家族聚居地區居住、行醫;（3）具有行醫資格證書。

1.1.2? 調查問卷的設計? 問卷總體分為兩個部分，第一部分統計被調查者基本信息，主要包括被調查者性別、民族、居住地址、受教育程度、行醫工作情況等;第二部分調查土家醫對天麻和延齡草的臨床使用情況、土家族習用藥材情況等，調查問卷納入藥材來自《醫療機構處方常用土家藥手冊》[9]，并包含天麻、延齡草。

1.2? 基于網絡藥理學的新方構建與評價

根據問卷調查結果，選擇配伍頻率排名前3的藥物構建新方。為降低研究的復雜性，選擇“天珠散+1”模式構建新方，但并不排除其他模式組合效果更佳的可能性。利用網絡藥理學方法評選出最佳配伍，并對新方進行合理性與效益評價。

1.2.1? 藥物成分的獲取和篩選? 通過HERB（http：//herb.ac.cn/）、TCMID（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）、TCMIP（http：//www.tcmip.cn/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/）、化學專業數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn/）以及文獻搜集藥物相關化學成分。利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲取藥物成分的“Canonical SMILES”格式，其中未能通過直接搜索找到的成分可通過PubChem的“Draw Structure”功能繪制出化學結構生成SMILES。再通過SwissADME（http：//swissadme.ch/）在線平臺對成分進行成藥性篩選，篩選標準為GI absorption（腸吸收）為“High”，Druglikeness（類藥性）通過“Lipinski”類藥五原則，成藥性較好的藥物成分被認為是潛在活性成分。

1.2.2? 潛在活性成分靶點的預測? 利用Swiss TargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）（篩選Probability>0）與TCMSP（https：//tcmspw.com/）數據庫預測并搜集潛在活性成分作用靶點，并進行合并、除重處理。

1.2.3? 疾病相關靶點蛋白的收集? 通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）（篩選relevance score>10.0）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）（篩選approved targets）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數據庫，以“stroke”為關鍵詞進行檢索，收集腦卒中疾病相關靶點蛋白。

1.2.4? 新方最佳配伍的確定? 利用Cytoscape 3.8.0軟件構建腦卒中相關靶點蛋白相互作用（protein protein interaction， PPI）網絡，導出蛋白節點拓撲數據。計算每個靶點度中心性（betweenness centrality）、緊密中心性（closeness centrality）以及度（Degree）3個參數的Z值，將參數進行歸一化處理。再分別將新方所含藥物靶點與腦卒中相關靶點取交集，計算各自交集靶點的總Z值，依此排序確定最佳配伍新方。

1.2.5? 基于土家藥“主幫客信”配伍原則的新方效益評析? “主幫客信”原則為土家族藥物配伍常用法則，其中主藥，方中必不可少;幫藥，幫助主藥或治療兼病;客藥，一是克制主藥過火，二是治療兼病之“客氣”藥;信藥，即藥引子[10]。主主相伍，功效相加;主幫相輔，增加功力;主客相敬，減少反應;主迎信達，暢通經脈[11]。遵循“主幫客信”配伍原則，分析新方配伍關系，評價其效益性。

腦卒中主要癥狀為半身不遂、口舌歪斜、言語謇澀和猝然昏仆等，次要癥狀包括頭痛、眩暈等[12]。SymMap數據庫（http：//www.symmap.org/search/）為中醫藥證候關聯數據庫，通過該數據庫分別檢索“半身不遂”“口舌歪斜”“言語謇澀”“猝然昏仆”“頭痛”“眩暈”，收集癥狀靶點。分別將癥狀靶點與所收集的腦卒中相關靶點取交集，剔除其中非交集靶點部分，余下的即是腦卒中疾病相關癥狀靶點。將腦卒中疾病相關癥狀靶點分別與最佳新方藥材的潛在靶點取交集，交集靶點分別導入STRING數據庫，利用其“Analysis”功能對靶點參與的生物過程進行富集分析。

1.3? 分子對接與通路富集分析

構建新方與腦卒中癥狀交集靶點PPI網絡，利用iGEMDOCK 2.1軟件對網絡關鍵靶點與其對應成分進行分子對接。PubChem數據庫下載小分子化合物結構，通過Open Babel 3.1.1軟件對化合物進行格式轉換，保存為mol2格式文件;RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/search）數據庫獲取蛋白結構，蛋白的種屬來源為“Homo sapiens”，且要求分辨率較高，保存蛋白為pdb格式文件。對接參數設置為默認。利用Metasacpe數據庫（https：//metascape.org/gp/）對交集靶點進行KEGG通路富集分析，構建中藥成分-靶點-通路網絡。

2 結果

2.1? 問卷調查結果

共發放調查問卷60份，收回問卷47份，回收率78.3%。根據問卷填寫情況，被調查對象均具有行醫資格證書，剔除來自非土家族醫生的問卷后，最后得到有效問卷28份。

2.1.1? 被調查對象基本情況? 被調查者多數來自我國土家族聚居地區，分別是湖南省湘西土家族苗族自治州（吉首市保靖縣、龍山縣、永順縣）、長沙市、張家界市、懷化市71.43%;貴州省銅仁市7.15%;湖北省恩施市10.71%（咸豐縣、鶴峰縣、來鳳縣）;重慶市10.71%（秀山縣、黔江區）。被調查者行醫時間多為30年及以上（42.86%），教育程度為本科居多（67.86%），行醫場所多在州級醫院（35.71%）。

2.1.2? 天麻、延齡草的臨床使用情況? 初步調查結果顯示，在治療腦卒中方面，天麻常與延齡草、八角楓、頭暈草、三角風、三百棒等配伍使用（圖1）;延齡草則常與天麻、三角風、八角楓、三百棒、五爪龍等配伍使用（圖2）。各自配伍頻率排名前3的藥物信息見表1。

2.2? 網絡藥理學研究結果

2.2.1? 最佳配伍的確定? 根據問卷調查結果，初步構建新方“天珠散+八角楓”（TZS-B）、“天珠散+三角風”TZS-S）、“天珠散+頭暈草”（TZS-T）。土家藥在配伍禁忌上主要遵守“草藥十四反”“生藥十三反”原則[13]，所構建的新方不違背土家族藥物傳統配伍禁忌。藥物成分的搜集、篩選以及靶點預測結果見表2。其中，天麻成分天麻素雖沒有通過篩選，但由于該成分屬于文獻[14]報道的活性成分，故納入后續分析。從GeneCards、DrugBank、TTD數據庫中共搜集得到449個腦卒中相關靶點蛋白。計算各新方與腦卒中疾病交集靶點相關拓撲參數的總Z值，Z（109.90）>Z（89.93）>Z（72.08），因而將TZS-T作為本研究中抗腦卒中的最佳配伍新方。

2.2.2? 基于土家藥“主幫客信”配伍原則的新方合理性評析? 通過SymMap數據庫分別得到半身不遂、言語謇澀、口舌歪斜、猝然昏仆、頭痛、眩暈癥狀靶點76個、27個、47個、116個、104個、58個。分別與所收集的腦卒中相關靶點取交集，剔除其中非腦卒中相關靶點后，各癥狀依次剩下靶點30個、13個、38個、50個、59個、29個。靶點參與的生物過程富集分析結果見圖3。天麻作為配伍的主藥，通過作用于MTOR、AR、JAK2、NR3C1等靶點，在對抗腦卒中疾病的主要癥狀方面發揮重要作用。延齡草通過作用于MTOR、NR3C1、APP、CCR1等與天麻素相同或不同的靶點發揮其幫藥作用。頭暈草與天麻的共同作用靶點較多，配伍中納入頭暈草或可降低天麻在方劑中的用量，從而減輕天麻的副作用，同時頭暈草也存在其獨有作用靶點，可能同時充當幫藥與客藥角色。頭暈是患者在服用天麻素片的過程中常見的副作用15]，頭暈草在民間使用中便有治療頭目眩暈的作用，也因此得名“頭暈”草，這也說明頭暈草可能作為客藥角色，克服天麻服用過程中所導致的頭暈反應。信藥可引導其他藥物的藥力到達病變部位或某一經脈。在分子層面，如果某藥物的成分能通過作用于某些靶點，幫助其他藥物分子或藥物相關蛋白實現跨膜運轉，則該藥物充當信藥角色。在對抗腦卒中猝然昏仆癥狀中，頭暈草靶點KCNH2、INSR、KCNJ11參與了跨膜轉運正調控的生物過程，則此時頭暈草充當了信藥角色。綜上，天麻、延齡草、頭暈草配伍或可增加藥物效應，減輕藥物副作用，新方TZS-T配伍合理。

2.3? 分子對接與通路富集分析

新方TZS-T藥物靶點與腦卒中癥狀靶點取交集得到31個靶點，在PPI網絡中Degree值排名前5的關鍵靶點分別是APP、IL-6、JAK2、MTOR、TLR4。分子對接結果見表3。圖4展示了各關鍵靶點與其藥物潛在活性成分的結合位點，并突出展示靶點與其最高結合活性成分的結合模式。天麻成分gastrodin與JAK2蛋白具有較高的結合活性，延齡草成分26-chloro-26-deoxycryptogenin、β-ecdysterone、ecdysterone分別與蛋白APP、IL6、MTOR具有較高的結合活性，頭暈草成分4-hydroxycinnamic acid與TLR4蛋白具有良好的結合活性。31個交集靶點主要涉及HIF-1信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路、NF-κB信號通路、PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、Jak-STAT信號通路等68條信號通路（P<0.05），圖5為中藥成分-靶點-通路網絡。

3 討論

少數民族醫藥中蘊藏著巨大寶藏，但目前其大量經驗方仍散落于民間、深藏于民間，由于缺乏系統的挖掘、整理與研究，一些療效獨特的民間驗方使用日趨減少，部分配方信息遺缺，難以發揮其應有的作用。對于土家族醫藥文獻的收集、發掘與整理工作始于20世紀70年代末或80年代初期[16]，天珠散收載于《鄂西藥物志》（對1978—1980年恩施地區衛生局組織的中草藥資源普查成果的匯總），其以“天珠散”為方名，首見于《土家醫方劑學》，為“神衰癥風痰型而設，臨床以頭暈目眩、失眠多夢、疲乏無力、舌胖大、苔白為治療要點”。但在土家醫描述疾病癥候的“三十六經癥”“七十二癥疾”中并未有“神衰癥”病癥名，據其臨床癥狀表述，可能與“頭風癥”“偏頭風”“虛陽灌頂癥”（相當于頭痛）等相關[17]。由上可知，源于當時區域性中藥資源調查獲得的“天珠散”及其傳統應用知識，在由口傳經驗向公共知識轉化的過程中，其土家醫傳統癥候與現代生物醫學背景下的適應癥有所關聯但卻并不一致。鑒于此，我們課題組提出并形成了適用于民族民間驗方的組方優化模式，即基于關鍵藥物評價的組方優化，將“理清配伍關系、合理增減組成、核準配伍劑量、明確臨床適應癥”為優化目標，其基本原則[18]包括：（1）遵循醫藥理論經驗原則;（2）原方主藥地位不變原則;（3）基于主藥關系的藥物增減原則;（4）主治范圍不脫離原方傳統功效原則;（5）組方藥物之間不沖突（安全性）原則;（6）經濟優效原則。通過整合數據，以基原清楚的共用藥物為線索，挖掘有效藥物組合作為原方增減依據，進行民族藥方劑的建構與優化。

網絡藥理學以系統生物學的理論為基礎，建立系統網絡模型，可從整體上考察藥物對疾病的干預與影響，揭示藥物、疾病、靶點與通路之間的復雜關系，有助于闡釋方劑配伍規律、預測中藥作用靶點、辨識中藥活性成分以及解析中藥作用機制[19]，已應用于中藥組方優化設計并取得了良好的成效。LI等[20]運用網絡藥理學方法，建立了可識別眾多草藥配方中草藥之間有用關系的基于距離的互信息模型，并以六味地黃丸配方為例，提出了跨中藥-生物分子-疾病多層網絡的“共模塊”概念，探討中藥配方潛在組合機制。LI等[21]提出了一種系統藥理學的集成平臺，用于揭示口服給藥、藥物半衰期和靶點相互作用如何影響草藥的藥理功能，并以小柴胡湯、大柴胡湯兩個經典方劑為例，進一步剖析了中藥加減法理論。張伏芝[22]運用網絡藥理學篩選優化了治療糖尿病周圍神經病變氣虛血瘀證的候選組方。本文運用網絡藥理學方法篩選新藥以優化天珠散組方并探究其分子機制。

本研究最佳新方由天麻、延齡草、頭暈草組成，天麻具有鎮靜、鎮痛、抗驚厥、改善記憶、神經保護、增強免疫等藥理作用[23];延齡草在鎮靜催眠、抗癌、抗炎和防治心肌缺血等方面表現出較強的藥理活性[24];頭暈草具有抗氧化、抗凝血、抗心肌梗死、提高機體抗應激能力等作用[25]。本文研究結果提示，新方或可通過參與一氧化氮生物合成過程調控、磷酸化的正調控、對含氧化合物的反應、神經元投射維持等眾多生物過程對抗腦卒中。缺血性腦卒中發生后，細胞因子IL-6、TNF-α以及APP蛋白等表達異常升高[26-27]，參與機體腦組織損傷過程。本研究發現，天麻素可能通過影響體內JAK2和NOS2蛋白的表達水平，參與神經遞質水平的調節、細胞因子產生的正調控等生物過程;延齡草成分bethogenin等可能通過作用于APP蛋白，參與炎癥反應、離子穩態調節等生物過程，干預腦卒中的頭痛和口舌歪斜癥狀;頭暈草富含鞣質，其水提醇沉物能促進大腦供血供氧，延長動物的存活時間[28-29]。

文章采用傳統知識調查方法對土家族民間驗方天珠散的配伍信息進行了重新挖掘，結合網絡藥理學分析結果，天珠散配伍頭暈草用于治療疾病腦卒中與原方相比可能具有更好的療效，再遵循土家族醫“主幫客信”的配伍原則，對新方進行了組方合理性評析，最后通過分子對接技術對新方抗卒中機制做了初步探討。文章內容或能為當前民間驗方的挖掘工作提供一些新的研究思路。不足之處在于網絡藥理學的方法還無法解決配伍用藥劑量問題，研究結果還有待于藥效及分子機制實驗的進一步驗證。

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